Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Hinweis: Das NLR-Seq-Protokoll besteht aus drei aufeinander folgenden Schritten: 1) Gewinnung von hochmolekularen Gewicht (HMW) genomischen DNA; (2) ultra-lange DNA Bibliotheksbau, die Fragmentierung der HMW DNA in die gewünschte Korngröße und Unterbindung der Sequenzierung Adapter an die DNA enthält endet; und 3) Laden der Adapter ligiert DNA auf die Arrays von Nanoporen (Abbildung 1). (1) HMW DNA-Extraktion Reagenz-Setup. 1 x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Puffer (1.000 mL) durch Zugabe von 100 mL PBS zu machen (10 X), 900 mL Wasser und gut mischen. Stellen Sie Lyse Puffer (50 mL) indem Sie eine 50 mL-Tube 43,5 mL Wasser hinzufügen. Fügen Sie 500 μl Tris (1 M, pH 8,0), Natriumchlorid (NaCl) (5 M), 1 mL 2,5 mL der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,5 M, pH 8,0) und 2,5 mL Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) (10 %, wt/Vol) am Rohr und gut mischen.Hinweis: Dieses PBS-Puffer kann bei 4 ° C für bis zu 6 Monate gespeichert werden. Die vorgefertigten Lyse-Puffer kann bei RT für bis zu 2 Monate gespeichert werden. Überprüfen Sie die Zelle Sterblichkeit und zählen Sie die Zellen zu. Sicherstellen Sie, dass das live-Verhältnis liegt bei > 85 % der gesamten Zelle ist 30 x 106.Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten Zellen sind von der HG00733-Zell-Linie, eine menschliche Lymphoblastoid Zelllinie Puerto-Ricanischer Herkunft am meisten benutzt in den 1000 Genome Consortium für strukturelle Variation Analyse (siehe Tabelle der Materialien für Bestellinformationen), dem gehört auf internationalen Genom Probe Ressource. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 X g für 5 min bei RT. verwerfen das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet (30 x 106 Zellen) mit 5 mL 1 X PBS-Puffer. Zentrifugieren Sie wieder bei 200 X g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den überstand.Hinweis: 25-35 x 106 Zellen sind akzeptabel für diesen Ansatz. Variation in Höhe von Zellen verwendet wird weiter weitere Optimierung benötigen. Die Zelle-Pellets kann bei −80 ° C für bis zu 6 Monate gespeichert werden. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 μl 1 X PBS-Puffer. Wenn einen gefrorene Zelle Pellet, mit 5 mL 1 X PBS-Puffer waschen. Die Lösung bei 200 X g für 5 min bei RT Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 200 μl 1 x PBS-Puffer. Bereiten Sie 10 mL Lyse-Puffer in einem 50 mL-Tube. Hinzu kommen 200 μl Zellsuspension die Lyse Puffer und Wirbel mit der höchsten Geschwindigkeit für 3 S. Inkubation die Lösung bei 37 ° C für 1 h. Fügen Sie 2 μl RNase A (100 mg/mL) um die lysate. Drehen Sie behutsam die 50 mL-Tube um die Probe zu mischen. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 ° C für 1 h. Fügen Sie 50 μL Proteinase K (20 mg/mL hinzu) der lysate. Drehen Sie behutsam die 50 mL-Tube um die Probe zu mischen. Inkubieren Sie die Lösung bei 50 ° C für 2 h. Während der Inkubation vorsichtig mischen der Probenmaterials alle 30 Minuten. Entfernen Sie die 50 mL-Tube von 50 ° C und bei RT 5 min stehen lassen. Die lysate 10 mL der Phenol-Schicht von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1, Vol/Vol/Vol) hinzu, und drehen Sie das Rohr auf einem Rotator-Mixer (siehe Tabelle der Materialien) bei RT in einer Dampfhaube bei 20 u/min für 10 min. wickeln die Rohr-Kappe mit Parafilm auslaufen zu verhindern während der Rotation. Bereiten Sie zwei 50 mL Gel Tuben (siehe Tabelle der Materialien) durch Zentrifugieren bei 1.500 X g für 2 min bei RTHinweis: Das Gel bildet eine stabile Barriere zwischen der Nukleinsäure-haltigen wässrigen Phase und dem organischen Lösungsmittel. Gießen Sie die Probe/Phenol-Lösung eines vorbereiteten 50 mL Gel Tuben aus Schritt 1.10. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 3.000 X g für 10 min bei RT Gießen Sie den Überstand in eine neue 50 mL Tube. Fügen Sie 10 mL der Phenol-Schicht von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1, Vol/Vol/Vol) und drehen Sie das Rohr auf einem Rotator-Mixer bei RT in einer Dampfhaube bei 20 u/min für 10 Minuten. Wiederholen Sie Schritt 1.11 einmal mit dem zweiten vorbereitet Gel Tube. Gießen Sie den Überstand in eine neue 50 mL Tube. Fügen Sie 25 mL eiskaltes 100 % Ethanol und drehen Sie sanft das Rohr von hand, bis die DNA (Abbildung 2) ausfällt.Hinweis: Der Niederschlag Ansatz hilft, um die HMW-DNA zu stabilisieren. Biegen Sie einen 20 μl-Tipp, um einen Haken machen. Sorgfältig die HMW-DNA mit den Haken herausnehmen und die Flüssigkeitstropfens ablassen. Legen Sie die HMW-DNA in ein 50 mL-Tube mit 40 mL 70 % igem Ethanol. Waschen Sie die DNA durch sanft das Rohr 3 mal umdrehen. Wiederholen Sie Schritt 1.15 einmal DNA aus der Tube 70 % Ethanol zu sammeln. Legen Sie die HMW-DNA in eine 2 mL-Röhrchen mit 1,8 mL 70 % igem Ethanol. Zentrifugieren Sie die gewaschenen HMW DNA bei 10.000 X g für 3 s bei RT. Entfernen Sie so viel von den restlichen Ethanol wie möglich durch pipettieren.Hinweis: Stören Sie das DNA-Pellet nicht, wenn die verbleibende Ethanol pipettieren. Inkubieren Sie der 2-mL-Tube bei 37 ° C für 10 min bei geschlossenem Deckel offen für die Probe trocknen. Wenn weiter mit Schritt 2.1 (mit mechanischen Scheren und 1 D Ligation Sequencing Kit), Hinzufügen der 2 mL Tube 1 mL TE (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 8,0). Wenn weiter mit Schritt 2.2 (mit Transposase-basierte Fragmentierung und schnelle Sequencing Kit), fügen Sie 200 μl 10 mm Tris (pH 8,0) mit 0,02 % Triton x-100.Hinweis: Bitte nicht stören Sie das DNA-Pellet. Das Rohr für 48 h bei 4 ° C im Dunkeln stehen zu lassen hilft die Probe vollständig aufzuwirbeln. Die HMW-DNA kann bis zu 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Längere Lagerzeit oder anderen Lagerbedingungen können mehr kurze Fragmente einführen. (2) ultra-lange DNA Bibliotheksbau Hinweis: Es gibt zwei Möglichkeiten, die Ultra-langen DNA-Bibliotheken basierend auf zwei verschiedene Scheren Methoden gepaart mit Nanopore Sequenzierung Kits zu konstruieren. Eine mechanische Scheren-basierte Bibliothek produziert Daten mit einem N50 von 50-70 kb, Einnahme von ca. 8 h für die Bibliotheksbau. Eine Transposase Fragmentierung-basierte Bibliothek erzeugt ein N50 von 90-100 kb Daten, wobei nur 90 min. für den Bibliotheksbau. Das mechanische Scherkräfte Protokoll gibt höhere Ausbeute aus der gleichen DNA Eingang mit identischen Versionen der Sequenzierung Adapter und Qualität der Nanopore Durchflusszellen. Mechanische Scheren-basierte Bibliotheksbau Tauwetter und Mischen der Reagenzien aus der Ligatur kit (siehe Tabelle der Materialien). Tauwetter FFPE DNA Reparatur Puffer und Ende Reparatur/dA-Tailing Puffer auf Eis, dann Wirbel und Spinnen bis zu mischen. Tauen Sie Adapter-Mix (AMX) und Adapter Wulst Bindung Puffer (ABB) auf Eis, dann Pipette und Spin hinunter um zu mischen. Tauwetter liefen Puffer mit Kraftstoff-Gemisch (RBF) und Elution Buffer (ELB) bei RT, dann Wirbel und Spin um zu mischen. Tauen Sie Bibliothek laden Perlen (LLB auf) bei RT und Pipette mischen Sie vor dem Gebrauch. Einmal aufgetaut, halten Sie alle Kit-Komponenten auf dem Eis. Nehmen Sie die Enzyme nur im Bedarfsfall. RT bringen Sie die magnetische Beads für den Einsatz.Hinweis: Für eine Empfehlung zur magnetischen Beads zu verwenden siehe Tabelle Materialien. Überprüfen Sie die Qualität und Quantität der HMW DNA aus Schritt 1.21.1. Pipette, 20 μl DNA in neuen 1,5 mL Röhrchen aus drei verschiedenen Standorten in der HMW DNA-Röhre mit P200 breite Bohrung Tipps. Nehmen Sie 1 μL aus den drei Aliquote, die Konzentration, die mit einem Fluorometer und die Qualität mit einem UV lesen zu erkennen. Prüfen Sie mehrmals um die Ergebnisse zu bestätigen.Hinweis: Die erwarteten Ergebnisse sind in Abbildung 3Aangezeigt. Der OD-260/280 -Wert ist ca. 1,9 und der OD260/230 Wert ist ungefähr 2,3. Übertragung der verbleibenden 940 μL der HMW DNA in eine 50 mL Tube Kappe mit einem breiten P1000 trug Tipp. Aspirieren Sie alle DNA in eine 1 mL Spritze ohne Nadel. Die 27 G Nadel auf die Spritze setzen und alle DNA in die Kappe auswerfen, sanft und langsam (~ 10 s). Die 27 G Nadel von der Spritze abnehmen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4 und 2.1.5 für 29 Mal für insgesamt 30 Pässe durch die Nadel.Hinweis: Die sheared HMW-DNA können bei 4 ° C im Dunkeln gespeichert werden, für bis zu 24 Std. Qualitätskontrolle (QC) dringend, durch pulsieren-auffangen Gel-Elektrophorese empfohlen wird, aber es teuer und zeitaufwändig ist. Wenn ein 5-150 kb-Protokoll durchführen QC auf eine automatisierte Puls Feld Gel-Elektrophorese-Maschine für eine 20 h laufen verwendet werden. Die erwarteten Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Vorbereiten die DNA-Reparatur Reaktion in einem 0,2 mL Röhrchen durch Zugabe von 100 μl DNA-sheared HMW (20 μg), 15 μl der Proteinkinase DNA Reparatur Puffer, 12 μL FFPE DNA-Reparatur-Mix und 16 μL der Nuklease-freies Wasser. Mischen Sie die Reaktion durch Streichen sanft 6 Mal und drehen Sie auf Luftblasen entfernen. Inkubieren Sie der Reaktion bei 20 ° C für 60 min. Transfer der Probenmaterials in ein neues 1,5 mL Röhrchen mit P200 breite Bohrung Spitze. Die magnetische Beads durch Pipettieren oder vortexen aufzuwirbeln. Hinzu kommen 143 μL Perlen (1 X) der DNA Reparatur Reaktion und Mischung sanft durch Streichen der Röhre 6 x. Drehen Sie das Rohr auf einem Rotator-Mixer bei RT bei 20 u/min für 30 min. Spin-down der Probe bei 1.000 X g für 2 s bei rt das Rohr auf einer magnetischen Zahnstange für 10 min. halten Sie das Rohr auf die magnetische Rack und den Überstand verwerfen. Halten das Rohr auf die magnetische Rack, fügen Sie 400 μl von frisch zubereiteten 70 % Ethanol ohne zu stören das Pellet. Entfernen Sie das 70 % Ethanol nach 30 s. Wiederholen Sie Schritt 2.1.11 einmal. Spin-down der Probe bei 1.000 X g für 2 s bei RT der Schlauch wieder auf die magnetische Rack. Entfernen Sie alle verbleibenden Ethanol und an der Luft trocknen für 30 s. Trocknen Sie die Pellets nicht über. Entfernen Sie den Schlauch aus dem magnetischen Rack und fügen Sie 103 μL TE (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 8,0 hinzu). Sanft flick Flick das Rohr um sicherzustellen, dass Perlen in den Puffer fallen und sanft auf einem Rotator-Mixer für 30 min. bei RT inkubieren das Rohr alle 5 min. zur Wiederfreisetzung des Pellet-Unterstützung. Pellet-die Perlen der magnetischen Zahnstange für mindestens 10 min. Transfer 100 μL Eluat mit einem breiten P200 Tipp in einem 0,2 mL-Tube Bohrung. Bereiten Sie die Ende-Reparatur und dA-Tailing Reaktion in einer 0,2 mL Tube indem 100 μL der reparierten HMW DNA, 14 μL Ende Reparatur/dA-Tailing Puffer und 7 μL Ende Reparatur/dA-Tailing-Mix. Mischen Sie die Reaktion durch Streichen sanft 6 Mal, und drehen Sie auf Luftblasen entfernen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 20 ° C für 60 min, gefolgt von 65 ° C für 20 min, und halten Sie dann bei 22° C. Tipp: Transfer, die die Probe in eine neue 1,5 mL-Tube mit einem breiten P200 trug. Die magnetische Beads durch Pipettieren oder vortexen aufzuwirbeln. Fügen Sie 48 μL der Perlen (0,4 X) zum Ende Reparatur/dA-Tailing Reaktion und Mischung sanft durch Streichen der Röhre 6 Mal. Drehen Sie das Rohr auf einem Rotator-Mixer bei RT bei 20 u/min für 30 min. Wiederholen Sie Schritte 2.1.10-2.1.13 einmal. Entfernen Sie den Schlauch aus dem magnetischen Rack und fügen Sie 33 μL TE (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 8,0 hinzu). Sanft flick Flick das Rohr um sicherzustellen, dass Perlen in den Puffer fallen und sanft auf einem Rotator-Mixer für 30 min. bei RT inkubieren das Rohr alle 5 min. zur Wiederfreisetzung des Pellet-Unterstützung. Pellet-die Perlen der magnetischen Zahnstange für mindestens 10 min. Transfer 30 μL Eluat mit einem breiten P200 Tipp in eine neue 1,5 mL Tube Bohrung. Nehmen Sie die zusätzliche 1-2 μl, die Konzentration, die mit einem Fluorometer zu erkennen.Hinweis: Erholung der 5-6 μg bei diesem Schritt wird erwartet. Bereiten Sie die Ligatur Reaktion in der 1,5 mL Probe Tube durch Hinzufügen von 30 μl Ende repariert HMW DNA, 20 μL des Adapter-Mix (AMX 1D) und 50 μL der Blunt/TA-Ligatur-master-Mix. Mischen Sie die Reaktion durch Streichen sanft 6 Mal zwischen jedes aufeinanderfolgende Zugabe und Spin auf Luftblasen entfernen. Inkubieren Sie die Reaktion bei RT 60 min. Die magnetische Beads durch Pipettieren oder vortexen aufzuwirbeln. 40 μl Perlen (0,4 X) die Ligatur Reaktions-und Mischung sanft durch Streichen der Röhre 6 Mal. Drehen Sie das Rohr auf einem Rotator-Mixer bei RT bei 20 u/min für 30 min. Wiederholen Sie Schritt 2.1.10 einmal. Fügen Sie 400 μl der Adapter Wulst Bindung (ABB) Puffer in die Röhre. Wechseln Sie das Rohr sanft 6 Mal um die Perlen aufzuwirbeln. Setzen Sie den Schlauch wieder auf die magnetischen Zahnstange, die Perlen aus dem Puffer zu trennen und entsorgen Sie überstand. Wiederholen Sie Schritt 2.1.26 einmal. Spin-down der Probe bei 1.000 X g für 2 s bei RT der Schlauch wieder auf die magnetische Rack. Entfernen Sie alle verbleibenden Puffer und an der Luft trocknen für 30 s. Trocknen Sie die Pellets nicht über. Entfernen Sie den Schlauch aus der magnetischen Halterung und aufzuwirbeln Sie das Pellet in 43 μL der Elution Buffer. Sanft flick Flick das Rohr um sicherzustellen, dass Perlen im Puffer fallen und sanft auf einem Rotator-Mixer für 30 min. bei RT inkubieren das Rohr alle 5 min. zur Wiederfreisetzung des Pellet-Unterstützung. Pellet-die Perlen der magnetischen Zahnstange für mindestens 10 min. Transfer 40 μL Eluat mit einem breiten P200 Tipp in eine neue 1,5 mL Tube Bohrung. Nehmen Sie die zusätzliche 1-2 μl, die Konzentration, die mit einem Fluorometer zu erkennen.Hinweis: Erholung der 1-2 μg bei diesem Schritt wird erwartet. Die mechanische Scheren-basierte Bibliothek ist zum Laden bereit. Die Bibliothek kann auf Eis für bis zu 2 h bis Laden für die Sequenzierung gespeichert werden, bei Bedarf. Transposase Fragmentierung-basierte Bibliotheksbau Tauwetter die Reagenzien aus der Transposase kit (siehe Tabelle der Materialien). Tauen Sie Fragmentierung Mix (FRA) und schnelle Adapter (RAP) auf Eis und Pipette zu mischen. Auftauen Sequenzierung Puffer (SQB), Perlen (LB) laden, Puffer (FLB) spülen und spülen Tether (FLT) bei RT und pipette um zu mischen. Tauen Sie laden Perlen (LB) bei RT und Pipette, vor Gebrauch zu mischen. Einmal aufgetaut, halten Sie alle Kit-Komponenten auf dem Eis. Nehmen Sie die Enzyme nur im Bedarfsfall. Überprüfen Sie die Qualität und Quantität der HMW DNA aus Schritt 1.21.2.. Pipette, 20 μl DNA in neuen 1,5 mL Röhrchen aus drei verschiedenen Standorten in der HMW DNA-Röhre mit P200 breite Bohrung Tipps. Nehmen Sie 1 μL aus den drei Aliquote, die Konzentration, die mit einem Fluorometer und die Qualität mit einem UV lesen zu erkennen. Prüfen Sie mehrmals um die Ergebnisse zu bestätigen.Hinweis: Die erwarteten Ergebnisse sind in Abbildung 3 bangezeigt. Der OD-260/280 -Wert ist ca. 1,9 und der OD260/230 Wert ist ungefähr 2,3. Bereiten Sie die DNA-Tagmentation Reaktion in einem 0,2 mL Röhrchen durch Zugabe von 22 μL der HMW DNA, 1 μl 10 mm Tris (pH 8,0) mit 0,02 % Triton X-100 und 1 μL der Fragmentierung (FRA) mischen. Mix von Pipettieren mit einem breiten P200 trug Tipp so langsam wie möglich 6 Mal, kümmert sich nicht um Luftblasen einzuführen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 ° C für 1 min, gefolgt von 80 ° C für 1 min, und halten Sie dann bei 4 ° C. Transfer der Mischung in eine neue 1,5 mL Tube mit einem breiten P200 trug Tipp und gehen sofort weiter. Das Probenröhrchen 1,5 mL 1 μL der schnellen Adapter (RAP) hinzufügen. Mix von Pipettieren mit einem breiten P200 trug Tipp so langsam wie möglich 6 Mal, kümmert sich nicht um Luftblasen einzuführen. Inkubieren Sie die Reaktion bei RT 60 min.Hinweis: Die Transposase Fragmentierung-basierte Bibliothek ist zum Laden bereit. Die Bibliothek kann auf Eis für bis zu 2 h bis Laden für die Sequenzierung gespeichert werden, bei Bedarf. 3. Sequenzierung auf dem Nanopore-Gerät Überprüfen Sie die Nanopore-Sequenzierung-Gerät (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie sicher, die Software und Hardware arbeiten sowohl genügend Speicherplatz vorhanden ist. Überprüfen Sie die Messzelle. Öffnen Sie eine neue Messzelle und setzen Sie die Messzelle in die Nanopore Gerät. Überprüfen Sie das Feld des Standortes der Messzelle an (X1-X5) eingefügt wurde. Wählen Sie den korrekten Fluss Zelle. Klicken Sie auf Überprüfen Flow Zellen Workflow. Klicken Sie auf Test starten , um die Durchflusszelle QC Analyse starten.Hinweis: Wenn die Anzahl der gemeldeten total aktiven Pore weniger als 800 ist, verwenden Sie eine andere neue Messzelle für die Sequenzierung. Vorbereiten des Priming-Puffers. Für eine mechanische Scheren-basierte Bibliothek hinzufügen 576 μL des laufenden Puffer mit Kraftstoff-Gemisch (RBF) und 624 μL der Nuklease-freies Wasser in einem 1,5 mL-Tube. Wirbel und drehen bis die Mischung der Priming-Puffer. Fügen Sie für eine Transposase Fragmentierung-basierte Bibliothek 30 μl bündig Kräfte (FLT hinzu) das Rohr bündig Puffer (FLB). Wirbel und drehen bis die Mischung der Priming-Puffer. Bewegen Sie auf der Durchflusszelle Priming-Port-Abdeckung im Uhrzeigersinn, um den Priming-Port verfügbar zu machen. Legen Sie eine Pipette P1000 auf 100 μL und stecken Sie die Spitze in den Priming-Anschluss. Ziehen Sie zurück, ein kleines Volumen des Puffers (weniger als 30 μl), eventuell Luftblasen aus der Durchflusszelle zu entfernen. Pipettieren, sobald eine kleine Menge der gelben Flüssigkeit die Spitze tritt zu stoppen. Verwenden Sie eine P1000 Pipette 800 μl des Priming-Mix in der Messzelle über den Priming-Anschluss zu laden. Zur Vermeidung von Luftblasen Einführung fügen Sie 30 μl des Priming-Mix, decken Sie die Spitze des Hafens Grundierung zuerst, dann stecken die Spitze in der Grundierung Anschluss und fügen Sie langsam den Rest des Priming-Mix hinzu. Nehmen Sie die Spitze bei ca. 50 μL links. Fügen Sie den Rest des Priming-Mix auf der Oberseite der Priming-Port. Die Flüssigkeit wird im Inneren von selbst gehen. Verlassen Sie das Setup für 5 min inkubieren. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Bibliothek-Mix in der 1,5 mL Tube mit der Bibliothek.Hinweis: Für eine mechanische Scheren-basierte Bibliothek fügen Sie 35 µL Puffer mit Kraftstoff-Gemisch (RBF) ausführen, um 40 µL DNA-Bibliothek hinzu. Für eine Transposase Fragmentierung-basierte Bibliothek hinzufügen, 34 µL Sequenzierung Puffer (SQB) und 16 µL Nuklease-freies Wasser zu 25 µL DNA-Bibliothek. Öffnen Sie die Strömung Zelle Probe Port Abdeckung vorsichtig, um die Probenöffnung verfügbar zu machen. Verwenden Sie eine Pipette P1000 200 μL des Priming-Mix über den Priming-Port in der Messzelle hinzufügen, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass der Priming-Mix in der Messzelle durch die Probenöffnung nicht geladen wird. Legen Sie eine P200 Pipette auf 80 μl. Mischen Sie die Bibliothek mit einer großen Bohrung Spitze durch Pipettieren nach oben und unten 6 mal gerade vor der Verladung. Laden Sie die Bibliothek Mischung tropfenweise durch den Probenport in der Messzelle. Tropfen Sie jeder erst nach der letzte Tropfen in den Hafen vollständig geladen ist. Die Probe-Port-Abdeckung vorsichtig wieder und sicherstellen Sie, dass die Probenöffnung vollständig bedeckt ist. Verschieben Sie die Grundierung die Schutzkappe gegen den Uhrzeigersinn um die Grundierung zu schützen. Schließen Sie den Deckel Gerät. Klicken Sie auf den Neuen Test -Workflow. Geben Sie den Namen der Bibliothek, wählen Sie das richtige Zubehör gemäß den Verfahren verwendet, und überprüfen Sie, ob die Einstellungen korrekt (48 h laufen, Echtzeit-Basis-Calling ON) sind. Klicken Sie auf “Start” ausführen. Nach 10 min Aufzeichnen der Flow Cell-ID und die aktive Nanopore Zahlen (Gesamtzahl und jeweils vier Gruppen zahlen) aus der Informations. Analyse der Daten. Kopieren Sie die Daten auf einem lokalen Computer oder einem Cluster jederzeit die Sequenzierung oder wenn die Ausführung abgeschlossen ist. Verwenden Sie Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2), um die Sequenzdaten an die Referenz-Genom auszurichten. Die Sequenzierung Leistung von der rohen Sequenzdaten und die Achsen nach NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot) zusammenfassen.