ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله
Summary
تسلسلات طويلة القراءة يسهل الجمعية جينومات المعقدة وتوصيف التغير الهيكلي. يصف لنا طريقة لإنشاء تسلسلات طويلة جداً بالأنظمة الأساسية المستندة إلى نانوبوري التسلسل. ويعتمد النهج أمثل استخراج الحمض النووي تليها مكتبة تعديل الأعمال التحضيرية لتوليد مئات يقرأ كيلوباسي مع تغطية معتدلة من الخلايا البشرية.
Abstract
قراءة الجيل الثالث التي توفر تكنولوجيات تسلسل الحمض النووي جزيء واحد لم يعد إلى حد كبير المدة التي يمكن أن تيسر الجمعية جينومات معقدة وتحليل المتغيرات الهيكلية المعقدة. منصات نانوبوري إجراء تسلسل جزيء واحد بقياس التغيرات الحالية بمرور الحمض النووي عن طريق المسام وساطة مباشرة، ويمكن أن تولد مئات من كيلوبس (kb) على ما يلي مع الحد الأدنى من التكاليف الرأسمالية. قد اعتمد هذا المنبر العديد من الباحثين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. تحقيق أطوال قراءة التسلسل هو العامل الأهم الاستفادة من قيمة منصات التسلسل نانوبوري. لتوليد يقرأ طويلة جداً، مطلوب اعتبارا خاصا لتجنب الكسور الحمض النووي واكتساب الكفاءة لإنشاء قوالب تسلسل الإنتاجية. هنا، نحن نقدم البروتوكول مفصلاً لزمن تسلسل الحمض النووي بما في ذلك ارتفاع الوزن الجزيئي (حمو) استخراج الحمض النووي من الخلايا الطازجة أو المجمدة، وبناء مكتبة بالقص الميكانيكية أو تجزئة ترانسبوساسي، وتسلسل على جهاز نانوبوري. من 20-25 ميكروغرام من “الحمض النووي حمو”، الأسلوب يمكن تحقيق N50 قراءة طول 50-70 كيلوبايت مع القص الميكانيكية و N50 من 90-100 كيلو بايت قراءة طول مع ترانسبوساسي بوساطة التجزؤ. يمكن تطبيق البروتوكول على الحمض النووي المستخرج من خلايا الثدييات لإجراء تسلسل الجينوم الكامل للكشف عن المتغيرات الهيكلية والجمعية الجينوم. تحسينات إضافية على استخراج الحمض النووي والتفاعلات الانزيمية سوف زيادة طول القراءة وزيادة فائدته.
Introduction
على مدى العقد الماضي، موازية لنطاق واسع وتكنولوجيات دقيقة للغاية التسلسل الفائق من الجيل الثاني دفعت انفجار اكتشاف الطبية الحيوية والابتكار التكنولوجي1،،من23. وعلى الرغم من أوجه التقدم التقني، قصيرة-قراءة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة منصات الجيل الثاني من غير فعالة في حل مناطق الجينوم معقدة ومحدودة في الكشف عن المتغيرات الهيكلية الجينوم (SVs)، التي تلعب أدواراً هامة في الإنسان تطور والأمراض4،5. وعلاوة على ذلك، قصيرة-قراءة البيانات غير قادر على حل تكرار الاختلاف وغير ملائمة للمميزين هابلوتيبي التدريجي للمتغيرات الجينية6.
التقدم الذي أحرز مؤخرا في تسلسل واحد جزيء عروض أطول بشكل ملحوظ قراءة الطول، التي يمكن أن تسهل الكشف عن النطاق الكامل ل SVs7،،من89، وعروض الجمعية دقيقة وكاملة لمجمع الجينومات الميكروبية والثدييات6،10. ينفذ منهاج نانوبوري تسلسل جزيء واحد بقياس التغيرات الحالية بمرور الحمض النووي عن طريق المسام11،،من1213وساطة مباشرة. خلافا لأي الكيمياء تسلسل الحمض النووي القائمة، يمكن أن تولد التسلسل نانوبوري طويلة (عشرات الآلاف من كيلوبس) ما يلي: في الوقت الحقيقي دون الاعتماد على حركية بوليميريز أو اصطناعية تضخيم عينات الحمض النووي. ولذلك، نانوبوري طويلة قراءة التسلسل (NLR-seq) يحمل وعدا كبيرا لتوليد أطوال قراءة طويلة جداً تتجاوز 100 كيلو بايت، التي ستعزز إلى حد كبير تحليل الجينوم والطب الأحيائي14، لا سيما في تعقيد منخفض أو الغنية بتكرار مناطق الجينوم15.
الميزة الفريدة للتسلسل نانوبوري قدرته على توليد طويلة يقرأ دون وجود قيود طول نظرية. ولذلك، طول القراءة تعتمد على طول الفعلي من الحمض النووي الذي يتأثر بصورة مباشرة بنوعية القالب النزاهة وتسلسل الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تبعاً لمدى التلاعب وعدد الخطوات التي تنطوي عليها، مثل قوات بيبيتينج وشروط الاستخراج، نوعية الحمض النووي اختلافاً كبيرا. ولذلك، أنها تمثل تحديا لأحد الخضوع الطويل ما يلي: بمجرد تطبيق البروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية والشركة المصنعة للمكتبة التي تم توفيرها أساليب البناء. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير قوي الأسلوب لتوليد طويلة جداً قراءة (مئات كيلوبس) تسلسل البيانات بدءاً من الخلية المقطوع الكريات. لقد اعتمدنا عدة تحسينات في إجراءات إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي. نحن تبسيط البروتوكول لاستبعاد الإجراءات غير الضرورية التي تسبب تدهور الحمض النووي والأضرار. ويتألف هذا البروتوكول من ارتفاع الوزن الجزيئي (حمو) استخراج الحمض النووي وبناء مكتبة الحمض النووي طويلة جداً وتعاقب على منصة نانوبوري. لإحياء الجزيئية المدربين تدريبا جيدا، يستغرق عادة 6 ح من الخلية الحصاد للانتهاء من استخراج الحمض النووي حمو، 90 دقيقة أو ح 8 لتشييد المكتبة اعتماداً على أسلوب القص، وحتى 48 ساعة أخرى لتسلسل الحمض النووي. استخدام البروتوكول ستمكن المجتمع الجينوم لتحسين فهمنا لتعقيد الجينوم واكتساب المعرفة الجديدة إلى تباين المجين في الأمراض التي تصيب الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
من حيث المبدأ، تسلسل نانوبوري قادرة على توليد 100 كيلو بايت ليقرأ مجباس بطول11،،من1213. أربعة عوامل رئيسية سوف تؤثر على أداء نوعية البيانات وتشغيل التسلسل: 1) أرقام المسام النشطة ونشاط المسام؛ 2) بروتين السيارات، الذي يتحكم في سرعة الحمض النووي مرورا نانوبوري؛ 3) قالب الحمض النووي (طول والنقاء والجودة، جماعية)؛ 4) تسلسل محول ربط الكفاءة، الذي يحدد الحمض النووي صالحة للاستعمال من العينة الإدخال. أول اثنين من العوامل تعتمد على الإصدار من الخلية تدفق وتسلسل مجموعة توفيرها من قبل الشركة المصنعة. ثاني العاملين هما خطوات حاسمة في هذا البروتوكول (استخراج “الحمض النووي حمو” والقص والربط).
يتطلب هذا البروتوكول من الصبر والممارسة. نوعية “حمو الحمض النووي” مهم ل مكتبات الحمض النووي طويلة جداً6. البروتوكول ويبدأ بالخلايا التي تم جمعها مع بقاء عالية (> 85% خلية قابلة للتطبيق المفضل)، يحد من الحمض النووي المتدهورة من الخلايا الميتة. وينبغي تجنب أي عملية قاسية مما قد يعرض الأضرار بالحمض النووي (مثلاً، قوية مثيرة للقلق، والهز، ودوامه، متعددة بيبيتينج، وتكرار تجميد وذوبان الجليد). في تصميم البروتوكول، يمكننا حذف بيبيتينج في عملية استخراج الحمض النووي برمتها. نصائح تتحمل واسعة تحتاج لاستخدامه عند بيبيتينج ضروري بعد القص الميكانيكية أثناء تشييد مكتبة وتسلسلها. نانوبوريس حساسة لكيمياء في المخزن المؤقت الدائرة12، هناك ينبغي أن الملوثات المتبقية قليلة (مثلاً، المنظفات، التوتر السطحي، الفينول، الإيثانول، البروتينات الكشف، إلخ) ممكن في الحمض النووي. ونظرا لطول والغلة، يبين طريقة استخراج الفينول نتائج أفضل وأكثر استنساخه بالمقارنة مع أساليب الاستخراج مختلفة متعددة اختبار حتى الآن.
وعلى الرغم من قدرة هذا البروتوكول على إنتاج تسلسلات طويلة للقراءة، لا تزال هناك العديد من القيود. أولاً، هذا البروتوكول كان الأمثل استناداً إلى جهاز التسلسل نانوبوري المتاحة في وقت النشر؛ وهكذا، يقتصر على كيمياء تسلسل الانتقائي القائم على نانوبوري ويمكن أن تكون دون المستوى الأمثل عند القيام بأنواع أخرى من أجهزة تسلسل طويلة للقراءة. ثانيا، والنتيجة تعتمد اعتماداً كبيرا على النوعية من الحمض النووي المستخرج من المواد البداية (الأنسجة أو الخلايا). طول القراءة ستتأثر إذا كان الحمض النووي انطلاق الفعل المتدهورة أو أضرار. ثالثا، على الرغم من أن العديد من الخطوات ومراقبة الجودة مدرجة في بروتوكول للتحقق من جودة الحمض النووي، المحصول النهائي وطول على ما يلي يمكن أن يتأثر تدفق الخلية والمسام النشاط، الذي يمكن أن يكون المتغير في هذه المرحلة المبكرة من منصة التسلسل نانوبوري التنمية.
هنا يستخدم بروتوكول وصف عينات خط الخلية البشرية تعليق لاستخراج الحمض النووي. ونحن قد الأمثل مرات يمر بإبرة القص، نسبة “الحمض النووي حمو” ترانسبوساسي والوقت عملية ربط لإنتاج نتائج وصف. ويمكن توسيع البروتوكول بأربع طرق. أولاً، يمكن للمستخدمين بدء مع خلايا الثدييات الأخرى المستزرعة وكمية مختلفة من الخلايا والأنسجة والعينات السريرية، أو الكائنات الحية الأخرى. ستكون هناك حاجة إلى مزيد التحسين في وقت الحضانة تفسخ وحجم رد الفعل والطرد المركزي. ثانيا، من الصعب التنبؤ بحجم الهدف لتسلسل قراءة طويلة جداً. إذا كانت أطوال اقرأ أقصر مما كان متوقعا، للمستخدمين ضبط مرات عابرة في الأسلوب القائم على القص الميكانيكية أو تغيير النسبة من “الحمض النووي حمو” ترانسبوساسي في الأسلوب القائم على تجزئة ترانسبوساسي. وقت الربط وشطف أطول خلال خطوات تنظيف مفيدة لأن “الحمض النووي حمو” عالية اللزوجة. ثالثا، مع أجهزة تسلسل نانوبوري مختلفة، واحد ضبط مقدار وحجم الحمض النووي لتلبية معايير جهاز التسلسل. رابعا، سوف التسلسل فقط الحمض النووي متصلة بمحولات التسلسل. لزيادة تحسين كفاءة عملية ربط، يمكن محاولة أحد تيتراتي تركيزات ليجاسى ومحول. ربط تعديل الوقت وعوامل الازدحام الجزيئية مثل شماعة18 يمكن تطبيقها في المستقبل. قد توفر فائقة طويلة البروتوكول تسلسل الحمض النووي جنبا إلى جنب مع كريسبر19،20 أداة فعالة لهدف إثراء التسلسل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون تشو Y. لتعليقاتها على المخطوطة. وأيد البحث عنها في هذا المنشور جزئيا المعهد الوطني للسرطان من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم P30CA034196. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Reagents | |||
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Agencourt AMPure XPbeads | Beckman | A63881 | magnetic beads for cleanup |
| BD conventional needles | Becton Dickinson | 305136 | 27G, for mechanical shearing |
| BD Luer-Lok syringe | Becton Dickinson | 309628 | for mechanical shearing |
| Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | for cell counting |
| EDTA | Invitrogen | AM9261 | pH 8.0, 0.5 M, 500 mL |
| Flow Cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106 | R9.4.1 |
| HG00773 cells | Coriell Institute | HG00733 | cells used in this protocol |
| Ligation Sequencing Kit 1D | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK108 | nanopore ligation kit |
| MaXtract High Density tubes | Qiagen | 129073 | gel tubes |
| NEBNext FFPE DNA Repair Mix | NEB | M6630S | |
| NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module | NEB | M7546S | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Phosphate-Buffered Saline, PBS | Gibco | 70011044 | 10X, pH 7.4 |
| Phenol:chloroform:IAA | Invitrogen | AM9730 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | 20 mg/mL |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | fluorometer assays for DNA quantification |
| Rapid Sequencing Kit | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RAD004 | nanopore transposase kit |
| RNase A | Qiagen | 19101 | 100 mg/mL |
| SDS | Invitrogen | AM9822 | 10% (wt/vol) |
| Sodium chloride solution | Invitrogen | AM9759 | 5.0 M |
| TE buffer | Invitrogen | AM9849 | pH 8.0 |
| Tris | Invitrogen | AM9856 | pH 8.0, 1 M |
| Triton X-100 solution | Sigma-Aldrich | 93443 | ~10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bio-Rad C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196EDU | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22628180 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | for cell counting |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | magnetic rack |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf | 5382000023 | for incubation |
| Freezer | LabRepCo | LHP-5-UFMB | |
| GridION | Oxford Nanopore Technologies | GridION X5 | nanopore device used in this protocol |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | rotator mixer |
| MicroCentrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | for UV reading |
| Pippin Pulse | Sage Science | PPI0200 | pulsed-field gel electrophoresis instrument |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | fluorometer |
| Refrigerator | LabRepCo | LABHP-5-URBSS | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-A236 | |
| Water bath | VWR | 89501-464 |
References
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
- Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).
- Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).
- Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).
- Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).
- Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).
- Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).
- Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
- Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).
- Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).
- Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).
- Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).
- Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).
- Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
- De Coster, W., D’Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
- Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615 (2013).
- Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. , (2017).
- Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. , (2018).
