في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول
Summary
نقدم هنا، بروتوكول الوصول للغاية لتقييم حركة الخلية في الخلايا البشرية تروفوبلست باستخدام ثلاثة فحوصات في المختبر: مقايسة الصفر والمقايسة غزو ترانسويل والمقايسة انتشار الخلايا.
Abstract
حركة الخلية خاصية حرجة من تروفوبلاستس أثناء وضع المشيمة والحمل المبكر. تتجلى أهمية الهجرة تروفوبلست السليم وغزو اضطرابات الحمل مثل تقييد النمو داخل الرحم، ومقدمات الارتعاج، التي ترتبط بغزو تروفوبلست غير كافية للمفرج الأمهات. ولسوء الحظ، أن فهمنا للآليات التي تتطور المشيمة من ترحيل trophoblasts محدود. تحليل في المختبر للهجرة الخلية عن طريق المقايسة الصفر هو أداة مفيدة لتحديد العوامل التي تنظم تروفوبلست القدرات المهاجرة. إلا أن هذا التحليل وحدها تحدد التغيرات الخلوية التي يمكن أن تؤدي الهجرة الخلية المتغيرة. يصف هذا البروتوكول ثلاث فحوصات في المختبر المختلفة التي تستخدم مجتمعة لتقييم حركة الخلية تروفوبلست: مقايسة الصفر والمقايسة الغزو والمقايسة الانتشار. كما يمكن تعديل البروتوكولات المذكورة هنا لاستخدامها في خطوط الخلايا الأخرى لقياس حركة الخلية في الاستجابة للمحفزات. هذه الطرق تسمح للمحققين تحديد العوامل الفردية التي تسهم في حركة الخلية وتوفير إجراء فحص دقيق للآليات المحتملة الكامنة وراء التغيرات الواضحة في الهجرة الخلية.
Introduction
التنمية المشيمة خطوة حاسمة في وضع الحمل، والتي تؤثر على صحة الأم والجنين على حد سواء. ومع ذلك، لم يتم فهم أساس الميكانيكية التي تحدث هذه العملية تماما. الهجرة الخلية هو عملية بيولوجية هامة أن يسهم في تأسيس ووظائف المشيمة أثناء الحمل. بعد انغراس الكيسة، يميز تروفيكتوديرم trophoblasts فيلوس، التي تغطي سطح الزوائد المشيمية ويشاركون في الغاز وتبادل المغذيات، وتروفوبلاستس اكسترافيلوس (افتس)، التي تهاجر خارجاً من الزوائد وتقتحم أوروبية والمفرج الأمهات1. هجرة افتس أمر ضروري لإعادة عرض الشرايين لولبية الأمهات وإقامة الدورة الدموية أوتيروبلاسينتال لدعم نمو الجنين2. غزو تروفوبلست غير كافية أثناء الحمل يؤدي إلى وضع المشيمة غير طبيعي وقد تسهم في مضاعفات الحمل مثل بريكلامبسيا ارتفاع ضغط الدم الحملي، وتقييد النمو داخل الرحم والولادة قبل الأوان3، 4. ولذلك، فهم العوامل التي تؤثر في حركية تروفوبلست ضروري لتحديد المسارات المطلوبة من أجل بلاسينتيشن العادية.
ويسيطر الهجرة تروفوبلست شبكة معقدة من إشارات الجزيئات، بما في ذلك عوامل النمو، السيتوكينات والهرمونات و عوامل الأوعية5. بسبب قيود الدراسة المجراة في المشيمة، خلد في المختبر فحوصات استخدام الخلايا البشرية تروفوبلست خطوط كانت حاسمة لتحديد العوامل التي تساهم في حركية تروفوبلست. وقد استخدمت فحوصات الصفر وغزو على نطاق واسع تقييم كمي دور الجزيئات الفردية على تروفوبلست خلية الهجرة6،،من78. ومع ذلك، كانت مفيدة في جنبا إلى جنب للتحقيق في كيفية التغييرات في الهجرة قد يكون سبب تغييرات في الخلية اختزاع، لا تراعي هذه الاختبارات اثنين إضافية من الآليات التي قد تساهم في تغيير معدلات الهجرة الخلية. على سبيل المثال، قد يؤدي تخفيض معدل انتشار الخلايا خلايا أقل المتاحة للهجرة.
هنا، يمكننا وصف الأساليب الكمية في المختبر لتقييم الهجرة تروفوبلست استخدام الصفر، وتكاثر الخلايا، وفحوصات غزو الخلية. في مقايسة الصفر، جرح موحدة يتم إنشاؤه في أحادي الطبقة خلية، ويقاس هجرة الخلايا إلى سد هذه الفجوة بالتصوير الآلي، والوقت الفاصل بين حجم الجرح وكثافة الخلايا داخل الجرح. تحليل انتشار الخلايا يستند حساب نسبة الخلايا في كل وقت نقطة مقارنة بكمية بداية معروفة من الخلايا. في مقايسة غزو الخلية، الخلايا هي تبذر فوق دائرة لإدراج ثقافة خلية المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية (مثل ترانسويل)، ويتم حساب عدد الخلايا التي تغزو عن طريق المصفوفة خارج الخلية استجابة للعلاج الكيماوي-جاذبة.
والرزن الصفر هو أداة بسيطة وفعالة يمكن استخدامها لتحديد ظروف بيئية مختلفة كيف تؤثر الهجرة الخلية. وبعد ذلك يمكن استخدام فحوصات انتشار وغزو لتحديد مساهمة تكاثر الخلايا واختزاع للتغييرات الشاملة في الهجرة الخلية. مجتمعة، هذه فحوصات توفير قياسات قوية للعمليات البيولوجية التي قد تساهم في حركية الخلية. واستخدمت السطرين خلية مخلدة الاثلوث الأول تروفوبلست في فحوصات وصفت، Swan.71 (Sw.71) و HTR-8/سفنيو9،10. ولكن أيضا يمكن تحسين هذه فحوصات لاستخدامها في أنواع الخلايا الأخرى لتحديد المغيرون الرئيسية الخلية الهجرة والغزو.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند هذا الإجراء استخدام الهجرة وغزو فحوصات تشمل معدل انتشار الخلايا كأحد مساهمين المحتملين لقياس الاختلافات في حركة الخلية تروفوبلست. تستخدم معا، هذه فحوصات في المختبر هي الطرق البسيطة والفعالة التي يمكن استخدامها لتحديد المسارات الخلوية التي تنظم الهجرة تروفوبلست. كما هو موضح أعلا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور جيل مور لتزويد الخلايا Sw.71. أيد هذا البحث “جائزة ألبرت مكيرن الباحث” إلى جنوب غرب
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
