במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.
Abstract
תנועת התא הוא מאפיין קריטי של trophoblasts במהלך הריון מוקדם ופיתוח היפרדות. המשמעות של הגירה trophoblast נאות ופלישה מומחש הפרעות ההריון כגון הגבלת גדילה תוך רחמי, רעלת היריון, אשר משויכות trophoblast לקוי הפלישה להערכת אימהית. למרבה הצער, שלנו להבנת המנגנונים מאת אשר השליה מתפתח נודדות trophoblasts מוגבל. ניתוח במבחנה של נדידת תאים באמצעות וזמינותו הזמני הוא כלי שימושי בזיהוי גורמים לווסת את קיבולת נודדות trophoblast. עם זאת, זו assay לבד אינו מגדיר את השינויים הסלולר שיכול לגרום נדידת תאים שהשתנו. פרוטוקול זה מתאר שלושה מבחני במבחנה שונים המשמשים יחדיו כדי להעריך את תנועת התא trophoblast: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה ואת וזמינותו התפשטות. ניתן לשנות את הפרוטוקולים המתוארים כאן גם לשימוש במבנים אחרים תא לכמת תנועת התא בתגובה לגירויים. שיטות אלה מאפשרות חוקרים כדי לזהות גורמים בודדים לתרום תנועת התא, לספק בדיקה יסודית של מנגנונים פוטנציאליים שבבסיס לכאורה לשינויים נדידת תאים.
Introduction
פיתוח היפרדות היא שלב חיוני בהקמה של ההריון, להשפיע על בריאות האמהי וגם העובר. עם זאת, הבסיס מכניסטית שבו מתרחש תהליך זה אינו מובן במלואו. נדידת תאים הוא תהליך ביולוגי חשוב אשר תורם הקמתה ואת הפונקציות של השליה במהלך ההריון. בעקבות ההשתלה הבלסטוציסט, מבדילה trophectoderm לתוך trophoblasts villous חלקית, אשר לכסות את המשטח של villi כוריוני מעורבים גז וחילופי מזין, trophoblasts extravillous (EVTs), אשר להעביר החוצה villi לפלוש אימהי רותמי, להערכת1. העברה של EVTs חיוני עבור שיפוץ ספירלה אימהי העורקים ויצירת מחזור uteroplacental כדי לתמוך גידול העובר2. הפלישה trophoblast לקויה במהלך ההריון התוצאה היא התפתחות לא תקינה היפרדות, עשוי לתרום הריון סיבוכים כגון רעלת, הריון יתר לחץ דם, גדילה המושבחים לידה לידה מוקדמת3, 4. לכן, להבין את הגורמים המשפיעים על תנועתיות trophoblast הוא חיוני לקביעת המסלולים הדרושים עבור placentation רגיל.
Trophoblast ההעברה נשלטת על ידי רשת מורכבת של מולקולות, לרבות גורמי גדילה, ציטוקינים, ההורמונים גורמי אנגיוגנזה5איתות. בגלל המגבלות של הלומדים את השליה ויוו, מבחני במבחנה ניצול מונצחים תא trophoblast האנושי קווים הייתה מכרעת לזיהוי גורמים שתורמים trophoblast תנועתיות. מבחני שריטה ופלישה נעשה שימוש נרחב להעריך באופן כמותי את התפקיד של מולקולות בודדות על trophoblast תא העברה6,7,8. עם זאת, בעוד שימושי במשולב כדי לחקור כיצד שינויים ההעברה עלולה להיגרם על ידי שינויים ב- invasiveness תא, אלה שני מבחני להסביר מנגנונים נוספים שעשויים לתרום שיעור שונה של נדידת תאים. לדוגמה, הנחות על קצב התפשטות תאים עלול לגרום תאים פחות זמין להעביר.
כאן, אנו מתארים במבחנה שיטות כמותיות להערכת trophoblast ההעברה באמצעות שריטות, התפשטות תאים מבחני חדירה לתא. ב וזמינותו מאפס, פצע אחיד נוצר בטפט התא, ההעברה של תאים כדי למלא את הפער נמדד על ידי הדמיה אוטומטית, בצילום מואץ של גודל הפצע צפיפות של תאים בתוך הפצע. תא התפשטות וזמינותו מבוסס על חישוב היחס בין תאים בכל נקודה בזמן לעומת כמות ההתחלתי ידוע של תאים. ב תא הפלישה וזמינותו, התאים הם נזרע על גבי תא הוספה התרבות תאים מצופים מטריצה חוץ-תאית (למשל Transwell), מספר תאים לפלוש דרך מטריצה חוץ-תאית, בתגובה כימותרפיה-attractant נספרים.
וזמינותו הזמני הוא כלי פשוט ויעיל יכול לשמש כדי לקבוע תנאים סביבתיים שונים איך להשפיע על נדידת תאים. מבחני התפשטות ופלישה עשוי לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את התרומה של התפשטות תאים, invasiveness לשינויים הכוללת נדידת תאים. באופן קולקטיבי, מבחני אלה מספקים מדידות חזקים של תהליכים ביולוגיים שעשויים לתרום תא תנועתיות. שתי שורות תאים מונצחים בטרימסטר הראשון trophoblast שימשו מבחני המתואר, Swan.71 (Sw.71), תיקוני-8/SVneo9,10. עם זאת, אלה מבחני עשוי גם ממוטב לשימוש בסוגי תאים אחרים כדי לזהות מאפננים מפתח של נדידת תאים, הפלישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך זה מתבסס על שימוש ההעברה הפלישה מבחני לכלול קצב התפשטות תאים כמו תורם פוטנציאלי להבדלים נמדד בתנועת התא trophoblast. נעשה שימוש יחד, מבחני במבחנה אלה הן שיטות פשוטה ויעילה שיכול לשמש כדי לזהות המסלולים הסלולר המסדירים trophoblast ההעברה. כפי שתואר לעיל, ניתן לטפל trophoblast תאים עם הורמונים, ציטוקינ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ד ר גיל מור על מתן התאים Sw.71. מחקר זה נתמך על ידי פרס אלברט מלומד מק’קרן כדי ייגמר בתיקו
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
