下流の単一細胞分析のため尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の分離

動物の取り扱いについてここで説明したすべてのメソッドは、科学、技術、研究、シンガポールの機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) シンガポールのゲノム研究所と代理店の生物学的リソース センターのによって承認されています。 1. マウス感染 ガラス管の準備 火気ソース (ブンゼン バーナーまたはアルコール バーナー) を点灯します。 両方の端をしっかりとつまんで両手毛細管ガラスを保持し、ガラスにソフト出るまで管の中を均等に加熱します。優しく前後もガラスの加熱で支援するためにその軸に沿って毛管を回転します。 ガラス管を熱源から外し、すぐに管の両端のグリップを維持しながらの手を離れて、引っ張る。引っ張られた毛細血管の理想的な最終的な長さは 3-5 cm シングル膀胱上皮細胞を分離するための適切な内部径を確保するため unpulled の毛細血管よりも長いです。注意:チューブはまだ時間の期間のための非常に熱いまま、ので次のステップに進む前に冷却するために数分間熱安全表面に毛細血管をおきます。 チェック ガラス管の中間となっているかどうかを参照してくださいに狭い (図 1A)、チューブの内部はまだ中空 (図 1B)。Ibc の分離、200-400 μ m の穴径は使用可能です。 片方の手で引っ張られた毛細血管の一方の端を拾います。一方、鉗子のペアを押しの狭いポイントで引っ張られたガラスキャピラリをピックアップするために使用します。それを粉砕することがなくしっかりと毛細血管をグリップに十分な力鉗子を振るったことを確認します。 鉗子を持つ手によって急速なひねりを使用して毛細血管の口 micropipetting を作成するのに最も狭いポイントで引っ張られた毛細血管をスナップします。注:ガラス破片から十分な保護を使用する限り、鉗子の代わりに指を使用は許容も。 手順 1.1.2-1.1.6 を繰り返し、少なくとも 4 倍以上十分な予備 micropipetting 毛細血管を生産し、IBC の分離のための直径の範囲を提供します。感染症グループの 1 つ以上が予想される場合は、グループごとに付加的な伝染 5 追加 micropipetting 毛細血管を準備します。注意:開いた炎を遮断することを忘れないでください。 100 mm のペトリ皿に引っ張られた毛細血管を配置し、毛細血管を殺菌する 30 分間紫外線に料理を公開します。 UV 殺菌後、シャーレの蓋を交換し、室温で毛細血管にペトリ皿を格納します。 感染する前にカテーテルの準備 尿カテーテルを感染感染する前に、少なくとも 1 日洪ら8コノバーら26で説明したように備えます。 蛍光尿路大腸菌培養の準備 選択した蛍光体を表現する尿路の細菌成長確立されたプロトコルに従ってひずみ。注:ひずみと蛍光体の選択は、顕微鏡と各施設で利用可能な系統によって大きく異なります。この例では、当初再発性膀胱炎患者からの臨床分離株である UTI89 から派生したひずみを使用します。これは、株は、SLC-638、運ぶプラスミド (労協-77) vsfGFP 9、カナマイシンの抵抗18を表す。SLC 638 は、流体培養基 LB の 50 μ g/mL カナマイシンを添加した 37 ° c で栽培されています。 縞のひずみ SLC 638 ルリア ベルターニカミラ (LB) に-50 μ G/ml カナマイシンを添加した寒天培地プレート。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。 (省略可能)植民地を選択する前に蛍光マーカーの発現を確認する解剖顕微鏡のプレートを表示します。 細菌接種ループを使用して、流体培養基 LB の 50 μ g/mL カナマイシンを添加した 10 mL と 125 mL の三角フラスコに選択したコロニーを転送します。24 h の 37 ° C で静的にフラスコを孵化させなさい。 サブカルチャーこのフラスコ フラスコから文化の 10 μ L をとり、流体培養基 LB の 10 mL で希釈してから細菌を新鮮な 125 mL フラスコ (1: 1000 希釈) で 50 μ g/mL カナマイシンを補った。別の 24 h の 37 ° C で静的にこの 2 番目のフラスコを孵化させなさい。 スピン ・ ダウン 5,000 × gで 5 分間、4 ° C の細菌文化 上清をデカントし、OD600 0.5 冷 PBS で細菌のペレットを再懸濁します。注:カルチャが異なる場合、通常静的文化の 1 mL を与える外径600の 4 ~ 5 mL 約 0.5 の細菌培養を =。それぞれのひずみは次のように計算できるために必要な菌量: 50 μ L が各マウス必須ですが、50 μ L が針の頭を埋めるために必要です。接種の追加の 10-20% (最低 50 μ L) をシリンジのデッド ボリュームを考慮して推奨します。 残りの細菌の混合物を使用すると、洪ら8に示す感染価を決定します。注:このステップは 4 ° C で細菌の混合物を格納することによって、数時間遅れる 尿路感染症のマウスモデル 前述の洪ら8、セクション 1.3 で培養されたエシェリヒア属大腸菌蛍光のそれぞれの株に 1 つの実験グループをマウスに感染します。注:また視覚補助のコノバーら26を参照してください。 マウスまたはケージの細菌の接種までの時間に注意してください。 全体の実験グループに感染を繰り返します。注:感染症カテーテルは、同じグループ内のすべてのマウスの再利用があります。 各実験群の手順 1.4.1-1.4.3 計画、新鮮なカテーテルと新しい潤滑剤ゲルをグループごと用意があることを確認します。注:多数の動物実験、動物を 5 つのグループに分割することをお勧め、各グループは、その感染症を驚異的な感染 1 時間に離れて約 30 分。これは次の手順 (セクション 2 および 3) に十分な時間を提供します。 2. 膀胱上皮細胞の細胞懸濁液を入手するために収穫 収穫とマウス膀胱を反転 3 つの 50 mL の円錐管滅菌手術用機器の 70% エタノール 45 ml を準備します。 2.1.1 準備したチューブの 2 つ、はさみのペアと各ピンセットのペアを配置します。3 管に鉗子 (できれば狭いと膀胱の転位のための丸みを帯びた先端の 1) の 2 つのペアを配置します。注:最初のチューブでツールを使用して、外部の地域に、膀胱が収穫で使用する 2 番目のツールおよび膀胱反転で使用される最後の管に鉗子の 2 つのペア。 6 h で感染症の記事、機関の確立した IACUC プロトコルによると感染マウスを安楽死させます。注:マウス麻酔 (イソフルラン) 中に実行する頚部転位による安楽死のため私たち IACUC プロトコルを呼び出します。 フラットに背中の動物を置くし、彼らの腹部領域を消毒する 70% のエタノールでいっぱいスプレー ボトルを使用します。 鉗子と (2.1.2 の手順で準備) 最初のチューブから外科はさみのペアを使用して、お肌、尿道の上約 1 cm の小さな横切開を開きます。マウス腹膜の内容を公開するの前部全体に沿って V 字カットの作成、マウスの上肢に向かって斜めに切開を展開します。このプロセス中にはさみカットしないでください (図 2a、B) マウスの腸の中を確認します。 (2.1.2 の手順で準備) ツールの 2 番目のセットに切り替えます。はさみの刃または鉗子のシャフトを使用して、優しく押し、マウスの骨盤領域の近くの脂肪パッド。注:この手順は外側に突出してに膀胱が発生し、収穫の可視性を保証します。 鉗子 (図 2C) のペアで頂点に露出した膀胱をグリップします。 切り取って (尿道や尿管を離れて切断) 動物の残りの部分から膀胱を無料鉗子を膀胱アペックスのしっかりしたグリップを維持し、手術用のはさみを使用して。膀胱をまだ保持鉗子を解放しません。 はさみから第三に円錐形から狭い丸い鉗子への切り替え (ステップ 2.1.2) からチューブは、それがちょうど前の手順 (図 2D) でカットされた場所膀胱の開口部に丸い鉗子の一方の軸の先端を挿入します。膀胱の開口部に安全に挿入丸い鉗子の先端、膀胱の頂点を把持鉗子のペアを解放し、2 番目の円錐管に戻る。 3 番目の管から鉗子の 2 番目のペアを使用して、そっと裏返し膀胱””、最初丸い鉗子 (図 2D矢印 1) から膀胱の口の外側の端を引っ張ってくると、周りの他の先端の上を指導丸みを帯びた鉗子 (図 2D矢印 2)。注:アクションは、片方の足から靴下を削除し、他の上引きに例えることができます。 反転過程では、最初の丸みを帯びたほぼ完全に閉じた鉗子のペアを保持します。これは丸い鉗子の第一のシャフトから膀胱をやってのけるに移動の十分な自由を提供していますがまた最初に近い丸みを帯びた鉗子の 2 つ目のシャフトをもたらすし、膀胱を簡単に転送することができます。この手順の最終的な結果が反転されていると鉗子 (図 2E) の最初のペアの 2 番目の軸の先端に、膀胱を終了します。 1 mL の冷 PBS に鉗子の先端から逆の膀胱をなだめすかす鉗子の 2 番目のペアを使用して、優しく。注:(省略可能)これは、逆にあれば一般的な頻度と、Ibc の分布を観察する感染した膀胱全体の画像を撮影する絶好のタイミングです。 (最大 5 匹の動物) に実験グループの各膀胱の手順 2.1.1-2.1.10 を繰り返します。 膀胱上皮細胞をこする 2 つの使用きれいに鉗子のペア、(ある内部上皮細胞層) 倒立膀胱の外側を優しくこすり。周囲の PBS が収入をこすると cloudier 表示されます、上皮細胞が PBS 溶液に解放されます。 (省略可能)視覚的に膀胱の削りが解剖顕微鏡を用いたソリューションに細胞をリリースしたことを確認します。図 3A、B)PBS は肉眼に目に曇りが表示され、掻き個々 膀胱上皮細胞は 10 倍の倍率で見ることができます。 ステップ 2.1 から各収穫の膀胱の手順 2.2.1-2.2.2 を繰り返します。 3. 細胞内細菌コミュニティ (IBC) 分離: IBCs の口ピペッティング 注:このセクションで説明されているすべてのメソッドは、機関のリスク評価を受けています。口ピペッティングが転送されているソリューションの摂取の固有の危険を運ぶ。このプロトコルを使用して、ナノリットル ボリュームによってこのリスクを軽減主とプロトコルの支払のすべてのユーザーに予防的に耳を傾けると実務ノートここで議論するをお勧めします。 セル後口 micropipetting 装置 (図 3C) を設定、PBS にスクレイプされて持っています。 吸引管のゴム栓 (白い側) に引っ張られたガラス管 (unpulled エンド) の厚い端を挿入します。 タイトなフィット感があること、吸引チューブの他のオープン (赤) の端に 1 mL ピペット チップの狭い端を挿入します。 2 mL のピペットを 1 mL ピペット チップの端に開いて、広い吸引の狭い端を挿入、フィット タイトながあることを再確認します。注:結果として得られるセットアップはキャピラリー チューブ装置のもう一方の端の狭い端から穏やかな吸引力を作成する吸引ピペットの広い、オープン エンドから口ピペットに研究者を許可します。 新鮮な純水を含む 100 mm ペトリ皿を使用して最終的な口 micropipetting 装置をテストします。吸引ピペット (ストローで飲み物を飲みながらに似ています) の開放端にわずかな吸引作用がキャピラリー内の液体のレベルを上げるが、脱イオン水に吸引チューブにオーバーフローを引き起こさない。ペトリ皿の位置を調整するのに他の手を使用している間キャピラリー チューブを制御するのに 1 つの手を使用します。注:口ピペッティング単一 IBC に必要な吸引力は、研究者の間で異なります。ただし、この手法を試みている各研究員が弱い吸引から開始し、毛細血管を流れている液体がない場合、それを徐々 に増やすことをお勧めします。飲料用缶にストローを吸うより大きい力の必要はありません。3.1.4 のステップでテスト中に液体を拾うことに毛細血管が表示されない場合毛細血管や吸引管が妨げられていると交換が必要です。さらには、水を用いた口分注装置の吸引を制御するすべての新しい研究者最初練習に殺菌をお勧めします。なお、研究者の舌を使用して口の分注装置によってとらボリュームのコントロールであります。舌が細かく適用、吸引の強さを調整し同様緊急停止として機能します。 液体の正常な吸収を達成した後に、優しく吸引ピペットの開放端に吹くことによって毛細血管からそれを追放する能力をテストします。3.5 段階、IBCs の汚染を防ぐために液体を追放の過程で気泡が作成されないことを確認します。注:として吸引、遠心管に、IBC を追放する研究者によって適用される肯定的な圧力の強さは変わるでしょう研究者の間で。このプロトコルに新しい研究者は、実践手順 3.1 数日実際感染前にそれをお勧めします。練習の口 micropipetting の 1 つの提案は少量の滅菌水を数滴口ピペット装置を用いた食品色素 (可視化) のための混合を転送する練習です。 解剖顕微鏡の下で掻き細胞懸濁液を置き、大きな蛍光凝集体 (図 3A, B) として、IBCs を識別します。倍率の理想的な範囲は、20-40 x です。1 のための PBS の新鮮な管に細かいガラス管末を浸して毛細管を通じて不要なボリュームの取り込みを抑える s。 顕微鏡を通して見る、興味の IBC を識別し、ゆっくり、IBC へキャピラリー チューブの開放端をもたらします。2 つ以上のセルの吸引を防ぐため、細胞の大きな集合体離れてを破る各 IBC に近い余分な細胞を一掃するのに微細ガラス管末を使用します。 顕微鏡をのぞきながらガラス毛細管に IBC を導くための口 micropipetting 装置の遠端 (吸引ピペット) に非常に小さな吸引力を適用します。 IBC を拾って後、空の 1.5 mL 遠心チューブにキャピラリーを移動し、遠心分離機管 (図 3D) に液滴と IBC を追放するわずかな肯定的な圧力を適用します。 多く IBCs が次の膀胱に進む前に、現在の膀胱から必要に応じてに 3.3 3.6 の手順を繰り返します。吸引ピペットと頻繁、唾のビルドアップを防ぐため毛細血管を変更します。注意:細菌の菌の伝染 (または臨床) を操作する場合は、キャピラリーのソリューションのレベルを常に監視します。液体が吸引チューブに毛細血管の縁からのオーバーフローの戻のレベルをさせてください。この場合、すぐに別の吸引チューブに切り替えて、アップ前のセットを破棄します。 3.2 3.6 すべて収穫した膀胱または実験群の生物試料の十分な数が収集されてまでの手順を繰り返します。 (省略可能)手順 3.6、3.7 を繰り返しているされて安楽死させすべて実験グループ (またはマウス)、十分な生物試料が各グループから収穫されています。