JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/58829
, , , , ,
1Infectious Diseases Group,Genome Institute of Singapore, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering,National University of Singapore, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Yong Loo Lin School of Medicine,National University of Singapore

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה של לבודד תאים אפיתל יחיד, שלפוחית השתן נגוע של המודל מאתר של דלקת בדרכי השתן.

Abstract

במאמר זה, אנחנו חלוקה לרמות הליך נהגו לבודד את קהילות חיידקי תאיים בודדות של עכבר זה נדבק בווירוס השפעול בדרכי השתן. הפרוטוקול ניתן לחלק לשלושה חלקים: זיהום, קציר תאים אפיתל שלפוחית השתן, או micropipetting הפה בידוד תאי האפיתל הנגוע בודדים. תא אפיתל מבודד מכיל תאים חיידקיים קיימא, כמעט ללא תשלום של מזהם חיידקים חוץ-תאית, שהופך אותו אידיאלי עבור ניתוח מתא בודד במורד הזרם. הזמן שנלקחו ההתחלה של זיהום להשגת קהילה חיידקי תאיים יחיד הוא בערך 8 שעות. פרוטוקול זה לא יקר לפרוס ומשתמש בחומרים זמינים באופן נרחב, אנו צופים כי זה יכול גם להיות מנוצל במודלים אחרים זיהום ‘ כדי לבודד תאים נגועים בודדים מן התא תערובות גם אם תאים נגועים אלה הם נדירים. עם זאת, בשל סיכון פוטנציאלי בתוך הפה micropipetting, פרוצדורה זו אינה מומלצת מאוד מדבקים.

Introduction

דלקת בדרכי השתן (זיהומים) הם אחד זיהומים חיידקיים השכיחה ביותר. המשוער 40-50% מהנשים צפויים לחוות לפחות אחד זיהום בדרכי השתן (UTI) במהלך כל החיים שלהם1. אחד הסוכנים הראשיים של UTI הוא uropathogenic e. coli (UPEC), אילו חשבונות עבור יותר מ 70% של אוטיס מסובכת2. יתר על כן, בערך רבע של אלו של UTI יהיה זיהום חוזר ונשנה, לעיתים קרובות נגרמת על ידי המתח זהה, למרות טיפול אנטיביוטי מתאים3. שכיחות גבוהה של UTI מייצג נטל משמעותי במערכות הבריאות, עולה יותר מ 2 מיליארד דולר בשנה ב ארה ב4. יתר על כן, השימוש באנטיביוטיקה לטיפול זיהומים בדרכי השתן מוביל גם המחירים העולה עמידות לאנטיביוטיקה, וזו הדאגה לבריאות הציבור העיקריים5.

לכן, מאמץ גדול הושם אל תוך הבנת המנגנונים שבאמצעותו UPEC מדביק בדרכי השתן, כמו גם היכולת שלו לגרום דלקות חוזרות ונשנות-6,–7,–8. בפרט, דגם העכבר של זיהום שימש לבחון מאפיינים בקטריאלי, המארח שתורמים UTI8. זה המודל העכבר יש את היתרון של להיות רלוונטי שלא שונתה זנים קליניים מבודדים מחולים אנושי. מודל זה הוביל גם הגילוי של מסלולים חיידקי druggable פוטנציאל חשוב עבור הקמת UTI, כגון סוג 1 pilus9 ו ברזל רכישת מערכות10.

לעומת הצלחות אלה לומדים את האירועים מוקדם ב- UTI, ידע של המנגנונים UTI חוזרים ונשנים עדיין חסר11. אחת ההשערות היא כי UPEC מתחמק טיפול אנטיביוטי גורם דלקות חוזרות בשלפוחית השתן על ידי יצירת קהילות חיידקי תאיים (IBCs) בתוך תאי אפיתל שלפוחית השתן. IBCs זוהו במודלים מאתר של זיהום והן אנושית UTI חולים12,13. הנוכחות של IBCs בדגימות שתן מחולים UTI בילדים היה קשור עם שיעור גבוה יותר של הישנות14,15. עם זאת, בידוד IBCs וללמוד את החיידקים בתוכם הוכיחה להיות טכנית מאתגר בשל נדירותם; ההערכה היא כי מאתר שלפוחית השתן נגוע בדרך כלל יש רק 10-100 IBCs16. יתר על כן, תאי אפיתל שלפוחית השתן גדולות יחסית (50-120 מיקרומטר)17, שהופך אותו מאתגר לפרוס פלורסצנטיות בסיוע מיון תא (FACS) לאור העובדה חרירי FACS טיפוסית מתוכננים עם קטרים של מיקרומטר 70 או 100 מיקרומטר. לפיכך, תאים גדולים כמו תאים אפיתל שלפוחית השתן מוסרות לעיתים קרובות על-ידי סינון לפני FACS כדי למנוע סתימת פלואידיקה.

המעבדה שלנו לאחרונה תיאר שיטה כללית וחסכוני לבודד תאים נגועים נדיר של תערובות כגון שרוטים לתאי האפיתל של שלפוחית השתן18. לבודד ביעילות IBCs, השתמשנו הפה מסורתיים pipetting. Micropipetting הפה הוא טכניקה זמן רב השתמשו המיקרומניפולציה של תאים בודדים, העוברים על ניתוח במורד הזרם19,20,21,22,23, 24 , 25. הפה מסורתי pipetting כמויות גדולות נוזלי (ב מיליליטר) לעיתים קרובות היה הגורם מעבדה בנושא תאונות, הטכניקה התרחקה בצדק בהרבה של קהילת המחקר מחוץ אמבריולוגיה מסורתי, יישומים תא בודד. פרוטוקול שלנו הוא בהשראת הגירסאות תא בודד של19,טכניקה20, אשר לצמצם את הסיכון באמצעות חוצץ גדול (> 2 מ”ל) של אוויר בין החוקר לבין מדגם לעומת הנפח של נוזלים הועבר (< 1 ΜL). שיטה זו גם מנצל הפקד בסדר הפה micropipetting מספקת, אשר מתורגם נפח סופי נמוך סביב פתרון הועבר וטוהר גבוהה של תאים מבודדים. הטכניקה משתמשת חומרים זולים (< 50 דולר), וכך צריך להיות ריאלי ליישם כל מעבדות.

פרוטוקול חזותי זה מתאר את הטכניקה הבידוד שלנו IBC, ומספק הפניה כדי לסייע לחוקרים אחרים המבקשים לשכפל בטכניקה זו. החוקר צריך גישה במיקרוסקופ ויבתר פלורסנט (או ציוד דומים) זה יכול לשמש כדי להמחיש תאים אפיתל בודדים, החיידק פלורסנט במהלך דימות בשידור חי, עם שלב ההדמיה פתוח ונגיש עבור micropipetting (ראה טבלה של חומרים עבור הפרטים של המיקרוסקופ משמש, על פי מודלים אחרים המקבילה כלי עשוי לשמש גם). בעוד פרוטוקול זה יתמקד IBCs במודל של מאתר של UTI, שיטות דומות צריך להיות רלוונטי לבודד תאים נגועים מ תא המתלים במודלים אחרים של זיהום.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בנוגע לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של המכון הגנום של סינגפור ביולוגית מרכז המשאבים של הסוכנות מדע, טכנולוגיה, מחקר, סינגפור. 1. עכבר זיהום הכנה של נימי זכוכית אור מקור להבה פתוחה (מבער בונזן או אלכוהול צורב). להחזיק כוס נימי בשתי ידיים על ידי בחוזקה צובט בשני הקצוות ולאחר מכן חום אמצע הצינור אחיד עד הכוס מתרכך. לסובב את נימי בעדינות הלוך ושוב לאורך ציר כדי לסייע אפילו חימום של הזכוכית. הסר את נימי זכוכית של מקור החום, מיד להפריד את הידיים, תוך שמירה על אחיזה בשני הקצוות של הצינור. אורך סופי אידיאלי נימי משך הוא 3-5 ס מ נימי unpulled כדי להבטיח של קוטר פנימי המתאים עבור בידוד תאים אפיתל שלפוחית השתן בודד יותר.התראה: הצנרת עדיין נשאר חם מאוד במשך תקופה של זמן, אז להפריש את נימי על משטח חסיני חום לכמה דקות להתקרר, לפני שתמשיך לשלב הבא. בדוק כדי לראות אם אמצע נימי זכוכית הפכה צר יותר (איור 1א’), כי הפנים של הצינור עדיין חלול (איור 1B). עבור בידוד של IBCs, נשא גודל של 200-400 מיקרומטר הוא שמיש. לאסוף את קצה אחד של נימי משך ביד אחת. להחזיק זוג מלקחיים עם היד השנייה, ולהשתמש בו כדי לאסוף את הזכוכית משך נימי בנקודה הצרה ביותר שלה. ודא כי המלקחיים הם להיתמם עם מספיק כוח כדי לאחוז את נימי בחוזקה מבלי למחוץ. את זה. השתמש ומפותלים תנועה מהירה על ידי היד האוחזת המלקחיים כדי להצמיד את נימי משך בנקודה הצרה ביותר ליצירת micropipetting הפה של נימי.הערה: באמצעות האצבעות במקום מלקחיים מתקבלת אף היא, כל עוד משמש הגנה נאותה מפני שברי זכוכית. חזור על צעדים 1.1.2-1.1.6 לפחות 4 x יותר לייצר מספיק micropipetting חילוף נימים, מספקים מגוון רחב של קטרים לבידוד IBC. אם אחד או יותר זיהום הקבוצה צפויה, להכין 5 נימים micropipetting נוספים עבור כל קבוצת זיהום נוספים.התראה: אל תשכח לכבות את הלהבה פתוח. למקם את הנימים משך 100 מ מ פטרי ולחשוף את המנה כדי קרינת UV למשך 30 דקות לחטא את נימי הדם. להחליף את המכסה. הפטרי לאחר עיקור UV ולאחסן את צלחת פטרי עם הנימים בטמפרטורת החדר. הכנת קטטרים לפני זיהום היכונו קטטר השתן זיהום כפי שמתואר Hung ואח8 ו- Conover et al.26 לפחות יום אחד לפני זיהום. הכנת פלורסנט uropathogenic e. coli תרבות לגדל את uropathogenic שנבחר לבטא fluorophore חיידקי זן לפי פרוטוקולים הוקמה.הערה: הבחירות של זן ו fluorophore תלויים במידה רבה המיקרוסקופ ואת הזנים הזמינים במעבדות בודדות. בדוגמה זו, אנו משתמשים זן נגזר UTI89, וזו בידוד קליניים במקור של חולה עם דלקת שלפוחית השתן חוזרות ונשנות. זה זן, SLC-638, נושא פלסמיד (pSLC-77) המבטאת התנגדות vsfGFP-9 והן kanamycin18. SLC-638 גדל LB מרק ב 37 ° C בתוספת 50 kanamycin µg/mL. פסים זן SLC-638-לוריא Bertani (LB)-צלחת אגר בתוספת 50 kanamycin µg/mL. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. (אופציונלי) להציג את הצלחת על המיקרוסקופ ויבתר כדי לאשר את הביטוי של סמני פלורסנט לפני בחירת מושבה. באמצעות לולאה חיסון חיידקי, להעביר את המושבה שנבחר בקבוקון חרוט 125 מ עם 10 מ ל מרק LB בתוספת 50 kanamycin µg/mL. דגירה. הבקבוק סטטית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. תת-תרבות מחיידקים את הבקבוק הזה. על-ידי לקיחת 10 µL של תרבות מן הבקבוק לדלל אותה ב- 10 מ ל מרק LB בתוספת 50 µg/mL kanamycin בבקבוקון טריים 125 מ ל (לדילול 1:1000). דגירה את הבקבוקון השני באופן סטטי ב 37 מעלות צלזיוס במשך עוד 24 שעות ביממה. ספין למטה התרבות חיידקי עבור 5 דקות ב 5,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. Decant את תגובת שיקוע, resuspend בגדר חיידקי ב- PBS קר על יתר600 של 0.5.הערה: למרות יכול להשתנות מתרבות לתרבות, בדרך כלל 1 מ”ל של תרבות סטטי נותן בערך 4-5 מ”ל של יתר600 = 0.5 התרבות חיידקי. הנפח הכולל של חיידקי inoculum הדרושים לצורך כל מאמץ יכול להיות מחושב כדלקמן: 50 µL נדרש עבור כל עכבר, 50 µL יש צורך למלא את הראש המחט. נוסף 10-20% (מינימום של 50 µL) של inoculum מומלץ לקחת בחשבון נפח מת במזרק. להשתמש את התערובת חיידקי הנותרת כדי לקבוע כייל את זיהום כפי שמתואר Hung et al.8.הערה: שלב זה עשוי להתעכב לכמה שעות על-ידי אחסון תערובת חיידקים ב 4 º C. דגם מאתר של דלקת בדרכי השתן להדביק את העכברים כפי שתואר על ידי Hung ואח8, עם קבוצה ניסיונית אחת עבור כל זן של פלורסנט e. coli תרבותי בסעיף 1.3.הערה: ראה גם Conover et al.26 לקבלת סיוע ויזואלי. הערה בפעם של חיסון חיידקי של העכבר או כלוב. חזור על זיהומים עבור קבוצת הניסוי כולו.הערה: אולי ניתן לעשות שימוש חוזר הקטטר זיהום עבור עכברים כל באותה קבוצה. חזור על שלבים 1.4.1-1.4.3 עבור כל קבוצה ניסיונית מתוכננות, המבטיח כי הצנתר טריים עם ג’ל סיכה חדשה ערוכה בכל קבוצה.הערה: לניסויים עם מספר גדול של בעלי חיים, מומלץ לחלק את החיות קבוצות של חמישה, התנדנדות דלקות כזה כי כל קבוצה הוא נגוע בערך 30 דקות ל- 1 h בנפרד. זה יספק מספיק זמן עבור השלבים הבאים (סעיפים 2 ו- 3). 2. שלפוחית השתן תאים אפיתל קציר לקבל השעיה תא קציר, היפוך שלפוחיות מאתר להכין 3 50 מ ל חרוט צינורות מלאים 45 מ של 70% כוהל לחיטוי ציוד כירורגי. לתוך, שני הצינורות מוכן בשלב 2.1.1 הניחו זוג מספריים, ואת זוג מלקחיים כל. מקום שני זוגות של מלקחיים (אחד רצוי צר יותר, עם טיפ מעוגלות, ההיפוך של שלפוחית השתן) לתוך הצינור השלישי.הערה: הכלים בהצינור הראשון ישמש על האזור החיצוני, הכלים השני ישמש להפקת שלפוחית השתן, שני זוגות של מלקחיים בצוואה התחתית האחרונה בשימוש היפוך שלפוחית השתן. ב- 6-אייץ ‘ פוסט זיהום, המתת חסד העכברים הנגועים לפי פרוטוקולים IACUC הוקמה של המוסד.הערה: פרוטוקול IACUC שלנו דורש המתת חסד דרך צוואר הרחם פריקה העכבר שמבוצע בהרדמה (איזופלוריין). להניח את החיות על גבם ולהשתמש בקבוק ספריי מלא 70% אתנול לחטא שלהם באזור הבטן. באמצעות זוג מלקחיים ומספריים כירורגי מהצינור הראשון (להכין בשלב 2.1.2), פתיחה לעשות חתך רוחבי קטן על העור כ- 1 ס מ מעל השופכה. להרחיב את החתך באלכסון לכיוון הגפיים העליונות של מצביע העכבר, יצירת חתך בצורת V לאורך כל הקדמי של העכבר שחושף את התוכן של הצפק. ודא כי במהלך תהליך זה, המספריים לא לחתוך דרך המעיים של העכבר (איור 2א, ב). לעבור הסט השני של כלים (להכין בשלב 2.1.2). משתמש על להבי המספריים או המוטות של המלקחיים, בעדינות לדחוף למטה על הפד שמן ליד האזור האגן של העכבר.הערה: שלב זה גורם שלפוחית השתן כדי לבלוט כלפי חוץ ומבטיחה הניראות עבור קציר. אחיזה שלפוחית השתן חשוף-השיא עם זוג מלקחיים (איור 2C). שמירה על אחיזה חזקה על השיא שלפוחית השתן עם המלקחיים, גזורה חינם שלפוחית השתן משאר החיות (חיתוך שופכה, ureters משם) באמצעות מספריים כירורגיים. לא לשחרר את המלקחיים מחזיק עדיין את שלפוחית השתן. המעבר מן המספריים המלקחיים מעוגל צר יותר של חרוט השלישי צינור (מתוך שלב 2.1.2), הכנס את קצה מוט אחד של המלקחיים מעוגל לתוך הפתח של שלפוחית השתן איפה הוא נחתך רק בשלב הקודם (איור 2D). עם קצה מעוגל המלקחיים בבטחה מוכנס לתוך הפתח של שלפוחית השתן, לשחרר את זוג מלקחיים כשתפסת השיא של שלפוחית השתן ולהחזיר את הצינור השני חרוט. באמצעות הזוג השני של מלקחיים מהצינור השלישי, בעדינות להפעיל שלפוחית השתן “מבפנים החוצה”, תחילה משיכת הקצה החיצוני של הפה של שלפוחית השתן מן המלחציים מעוגל (איור 2D, חץ 1), מנחה אותו להתגבר על הקצה השני של המלקחיים מעוגל (איור 2D, חץ 2).הערה: הפעולה משולה הסרת גרב רגל אחת, שולף את זה בצד השני. במהלך תהליך היפוך, לשמור על הראשון מעוגל זוג מלקחיים הושבת כמעט לחלוטין. זה מספק מספיק חופש התנועה כדי להצליח שלפוחית השתן מן הפיר הראשון של המלקחיים מעוגל, אבל גם מביא מוט השני של המלקחיים מעוגל קרוב לראשון ומאפשר שלפוחית השתן להעברה בקלות. תוצאה סופית של שלב זה היא כי שלפוחית השתן צריכה להסתיים להיות הפוכה והיא על קצה מוט השנייה של הזוג הראשון של מלקחיים (איור 2E). בעדינות באמצעות הזוג השני של מלקחיים, קונקטור שלפוחית השתן הפוך את הקצה של המלקחיים לתוך 1 מ”ל של PBS קר.הערה: (אופציונלי) זה הזמן המתאים לקחת תמונות של כל הפוכה, שלפוחית השתן נגוע לבחון את כללי התדירות והפצה של IBCs, אם בכלל. חזור על צעדים 2.1.1-2.1.10 עבור כל לשלפוחית השתן של קבוצת הניסוי (לכל היותר חמישה בעלי חיים). גירוד תאי אפיתל שלפוחית השתן משתמשת בשני לנקות זוגות של מלקחיים, לגרד בעדינות החיצוני של שלפוחית השתן הפוכה (שהיא שכבת תאים אפיתל פנימי). מגניב שמסביב אמור להופיע cloudier כמו גירוד ההכנסות ושוחררו לתאי האפיתל הם הפתרון PBS. (אופציונלי) מבחינה ויזואלית לאשר כי בשלפוחית השתן גירוד פרסמה תאים לתוך הפתרון באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. איור 3 A, B). מגניב להופיע מעונן בעין בלתי מזוינת, בתאי אפיתל שלפוחית השתן בודדים שרוטים ניתן לראות הגדלה x 10. חזור על צעדים 2.2.1-2.2.2 עבור כל שלפוחית השתן שנקטפו מהשלב 2.1. 3. תאיים הקהילה חיידקי (IBC) בידוד: הפה Pipetting של IBCs הערה: כל השיטות המתוארות בסעיף זה עברו הערכה הסיכון מוסדיים. הפה pipetting נושא הסיכון הגלום של בליעה של הפתרון מועבר. סיכון זה במידה רבה חמאני אמצעי האחסון nanoliter המשתמשת בפרוטוקול זה, אנו ממליצים כי כל המשתמשים של השכר פרוטוקול לב זהירות, תרגול הערות המפורטים כאן, בדיון. לאחר התאים הייתה שורטת לתוך PBS, להרכיב את המערכת micropipetting הפה (איור 3ג’). להוסיף בסוף עבה יותר משך זכוכית נימי (הסוף unpulled) לתוך התקע גומי (end לבן) של הצינור העצמות. הכנס הקצה הצר של קצה פיפטה 1 מ”ל הפתוח (אדום) השני של הצינור ליניקת, המבטיח כי יש צפוף. הכנס הקצה הצר של mL 2 כ רפה בעברית פיפטה בתוך הסוף פתוח, רחב יותר של קצה פיפטה 1 מ”ל, שוב להבטיח כי יש זמן מתאים.הערה: הגדרת וכתוצאה מכך מאפשר החוקר פיפטה בפה בסוף רחב יותר, פתוח פיפטה שואבת כדי ליצור כוח יניקה עדינה של הקצה הצר של הצינור נימי בקצה השני של המנגנון. בדוק את המנגנון micropipetting הפה הסופי באמצעות צלחת פטרי 100 מ מ המכיל מים יונים. פעולת יניקה קלה על קצה פתוח של פיפטה שואבת (בדומה לגימת משקה קש) צריך להעלות את רמת נוזלים נימי, אך לא לגרום המים יונים תציף לתוך הצינור העצמות. השתמש יד אחת כדי לקבוע את צינור קפילרי, תוך שימוש ביד האחרת כדי לכוונן את המיקום של הפטרי.הערה: עוצמת שאיבה הדרושים עבור הפה-pipetting IBC בודד ישתנה בין החוקרים. עם זאת, מומלץ כי כל חוקר ניסיון טכניקה זו להתחיל עם יניקה חלש, לאט להגדיל אותו אם אין נוזל זורם למעלה נימי. יש צורך כוח גדול יותר מציצת קש לשתייה. אם נימי אינו מופיע כדי לאסוף נוזלים במהלך הבחינה בשלב 3.1.4, זה אפשרי כי את נימי או הצינור. שואבת הוא occluded, צריך להחליף. מומלץ עוד יותר כי כל חדש חוקרים האימון הראשון שולט שאיבה במנגנון pipetting הפה באמצעות עיקור מים. בנוסף, שימו לב כי הפקד של אמצעי האחסון המנוצל על-ידי המנגנון pipetting הפה באמצעות הלשון של החוקר. הלשון יכולה דק לכוונן את עוצמת שאיבה חלה, כמו גם לשמש עצירת חירום. לאחר השגת ספיגת מוצלחת של נוזל, לבדוק את היכולת לגרש אותו מן נימי על ידי פיצוץ בעדינות לתוך הקצה הפתוח של פיפטה שואבת. ודא כי אין בועות נוצרות בתהליך גירוש הנוזל למניעת זיהום של IBCs במהלך שלב 3.5.הערה: כמו עם שאיבה, ישתנו הכוח של לחץ חיובי מצד החוקר לגרש את IBC לתוך הצינור צנטריפוגה בין החוקרים. מומלץ לחוקרים חדש פרוטוקול זה לשלב תרגול 3.1 ימים ספורים לפני הזיהום בפועל. הצעה אחת עבור תרגול micropipetting הפה היא להתאמן העברת כרכים קטנים של סטיריליים מים מעורבבים עם כמה טיפות של המאכל (עבור ניראות) שימוש במנגנון micropipette הפה. מקום התליה תא שרוטים תחת המיקרוסקופ ויבתר ולזהות את IBCs כמו גדולים אגרגטים פלורסנט (איור 3A, B). הטווח האידיאלי של ההגדלה הוא 20-40 x. לטבול בסוף בסדר נימי הזכוכית בתוך שפופרת טריים של PBS 1 s כדי להפחית את ספיגת של אמצעי האחסון לא רצויות דרך פעולה נימי. נראה מבעד למיקרוסקופ, לזהות את IBC עניין ולהביא לאט את הקצה הפתוח של צינור קפילרי לכיוון IBC. השתמש הסוף בסדר של נימי הזכוכית כדי לטאטא החוצה תאים נוספת ליד כל IBC כדי למנוע את השאיפה של שני תאים או יותר, או להיפרד אחד מהשני אגרגטים גדולים יותר של תאים. תוך התבוננות מבעד למיקרוסקופ, החל כוח יניקה מאוד קטן בקצה הרחוק (פיפטה שואבת) של המנגנון micropipetting הפה כדי להנחות את IBC לתוך נימי זכוכית. לאחר אוספת את IBC, לעבור את נימי שפופרת צנטריפוגה mL 1.5 ריקה ולהחיל בלחץ חיובי קל לגרש את ה-droplet ו IBC לתוך הצינור צנטריפוגה (איור 3ד’). חזור על שלבים 3.3-3.6 כמו IBCs רבים נדרשים משלפוחית הנוכחית, לפני ביצוע הפרוצדורה הבאה שלפוחית השתן. לשנות את שואבת פיפטות נימים לעתים קרובות כדי למנוע הצטברות של רוק.התראה: בעת עבודה עם זני חיידקים זיהומיות (או קליני), כל הזמן עוקב אחרי הרמה של פתרון נים. אל תתנו הרמה של להיות pipetted גלישה מקצה נימי לתוך הצינור ליניקת נוזלים. אם הדבר יתרחש, מיד לעבור צינור ליניקת שונים, ולמחוק את הערכה הקודמת למעלה. חזור על שלבים 3.2-3.6 על כל שלפוחיות שנקטפו, או עד מספר מספיק של דגימות ביולוגיות שנגבה עבור קבוצת הניסוי. (אופציונלי) חזור על שלבים 3.6 ו 3.7 עד שיש כבר מורדמים כל ניסיוני קבוצות (או עכברים) מספיק דגימות ביולוגיות נקצצו מכל קבוצה.

Representative Results

מלבד אישור (איור 3ד’) של המצאות IBC מבודד יחיד בצינור אוסף באמצעות המיקרוסקופ ויבתר, הטוהר של IBC מבודד יכולה גם להיות מאושרות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כפי שמוצג באיור 4א, תאים מבודדים צריך כתם עבור e. coli ו- uroplakin, גודל הצפוי עבור IBCs (50-120 מיקרומטר)17. יתר על כן, e. coli מכתים אינו נוכח בתוך הנוזל שמסביב. בהתבסס על הנתונים שלנו, יותר מ- 90% של תאים מבודדים עם טכניקה זו הם IBCs18. לאחר בידוד, הנוכחות ואת הכדאיות של תאי חיידקים IBC בודדים יכול להיות אישרו דרך המושבה ויוצרים יחידה (CFU) ספירה (איור 4B) או כמותית תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) עבור מקבילות גנומית ( איור 4 C)- איור 4C גם מדגים כי נגוע לתאי האפיתל מבודדת באותו הפרוטוקול אין כמויות לכימות של חיידקים. על סמך נתונים אלה, אנו מעריכים כי בטווח של CFUs ב IBC יחיד הוא2-10 103 במודל מאתר של דלקת בדרכי השתן. אחת המטרות העיקריות של בידוד IBC יחיד היא לבצע ניתוח במורד הזרם כגון רצפי RNA. כדי לוודא כי שיטת הבידוד שלנו הוא מסוגל להשיג RNA של חיידקים IBCs לניתוח, ביצענו שעתוק במהופך כמותיים פולימראז תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR) כימות של שלושה גנים (16, cyoB, ו frdA) עבור טווח IBCs במאגר מבודדים בנפרד (איור 4D). כל המידע המוצג באיור 4 הותאם באישור Duraiswamy et al.18. סקירה סכמטית פרוטוקול הבידוד שלנו IBC ניתן לראות באיור 5, אשר שוחזרו מ Duraiswamy et al.18. איור 1 : נימים משך ידו שומרים על פתחים צרים. (א) דוגמאות משך ידו צינורות קפילר מוצגים על רקע שחור ‘ ניגוד ‘. מלמטה למעלה, על נימי unpulled, נים זה נמשכה לא במידה מספקת, על נימי יכול לשמש עבור שלפוחית השתן יחיד קציר תאים אפיתל, נימי שמשך היה דק מדי (, ובכך מופרדים לתוך שתי חתיכות) מוצגים. סרגל 15 ס מ ממוקמת בתחתית התמונה בתור קנה מידה. נקודת המשוערת של הצמדת את נימי שמיש מציינים על הדמות החץ האדום. (B) התמונה נלקחה עם מיקרוסקופ ויבתר המאשרת את קוטר פנימי חלול נימי משך (למטה). נימי unpulled ממוקם מעל כדי להדגים את ההבדל בגודל היחסי של הנימים שני. סרגל קנה מידה = 4.0 מ”מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : ניתוח של העכבר כדי לקצור תאי אפיתל שלפוחית השתן- (א) תמונה של עכבר עם קווים לבנים הוסיף כדי לציין את מיקום משוער ואת הזווית של חתכים לחשוף את חלל הצפק מאתר ואת שלפוחית השתן. (B) תמונה של החשופים העכבר חלל הצפק שלאחר החתך. (ג) תמונה של החשופים שלפוחית השתן (חץ אדום) בולט בין הידיות השמן. (ד) תמונה של שלפוחית השתן מאתר עם הקצה של המלקחיים מוכנס לתוך לומן, עם החצים כדי לציין את הכיוון של התנועה הדרושים כדי להפוך את שלפוחית השתן. שלפוחית השתן הראשון נמשך מתחילות מעט ואז סביב והחוצה מוט הראשון של המלקחיים. כיווני תנועה לשני המעשים הם כפי שצוין על ידי החצים הלבנים ממוספרים 1 ו- 2. (E) תמונה המציגה את המיקום הסופי של שלפוחית השתן הפוכה מוכנס אל מוט השני של המלקחיים. המוטות של המלקחיים מסומנות בשתי החלוניות D ו- E עם חצים אדומים וטקסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : IBC קציר מתאי שלפוחית השתן- (א) שלפוחית השתן נגוע, הפוך בפתרון PBS קר לפני תא גירוד. (B) תמונה המציגה שיפשף תאים שלפוחית השתן כפי שנראה במיקרוסקופ. IBCs יכול להיות מזוהה אגרגטים ניאון ירוק גדול גם תמונות (ראה חצים אדומים). (ג) תמונה של השלים הפה micropipetting מכשיר. שואבת פיפטה עצה פיפטה, ליניקת צינור, צינור קפילרי משך מזוהים עם החצים ממוספרות כמצוין בצד הימין. (D) תמונה של יחידה מבודדת IBC הכליון אוסף 1.5 mL (המתוארים באדום). סרגלי קנה מידה (כפי שמצוין) מיוצגים על ידי קווים לבנים פאנלים א’, ב’ וד’ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : IBCs שנקטפו טהור והוא יכול לשמש לניתוח במורד הזרם. דמות זו שונתה באישור ואח Duraiswamy18. (א) תמונות של שני תאים GFP-חיוביות מבודד היו מוכתמים נוגדנים anti-uroplakin ו- anti -e. coli . התא הראשון (IBC 1) יש תמונות של ערוצים בודדים (בהגדלה נמוכה), משמאל, תמונת הממוזג גבוהה ההגדלה היא בצד הימין. התא השני (IBC 2) מוצג בהגדלה בערוצים הממוזג ואישי. סרגלי קנה מידה הן כמצוין. הדנ א הוא מוכתם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), מיוצגים בערוץ הצבע הכחול. אנטי -e. coli הוא מוכתם של נוגדנים משניים מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (FITC), ייצג לערוץ הצבע הירוק. Anti-uroplakin הוא מוכתם של נוגדנים משניים מצומדת כדי tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), ייצג את הערוץ האדום. CFUs חיידקי (B) מ- IBCs מבודדים. IBCs היו מעובדים באופן מיידי, או מודגרות ב- 0.1% טריטון-X עבור 10 או 30 דק CFU איחדו סעיפים של IBCs בודדים מבודד n = 3 ניסויים נפרדים מוצגים. גבול של זיהוי = יומן 0.710 CFUs/IBC. נקודות אדומות המותווית על גבול זיהוי מציינים דוגמאות אשר נמצאו אין מושבות. כל הדגימות המכילות IBC אינם שונים באופן משמעותי (p > 0.05, מבחן מאן-ויטני); בתאי אפיתל נגוע שונים באופן משמעותי הנתונים IBC (10 דקות) (0.001 <p , מבחן מאן-ויטני). (ג) qPCR כימות של חיידקים על IBCs בודדים ותאי אפיתל נגוע לאחר דגירה 10 דקות ב- 0.1% טריטון-X (*, p < 0.0001, מבחן מאן-ויטני, n = 4). גבול של זיהוי = 1.18 יומן10 גנום חיידקי מקבילות/מבני תעשייה. הנקודות האדומות מציינות דגימות שעבורו אין מושבות ששוחזרו על titering בלוח ב’ (D) כימות של מטוסי אף-16 גנים rRNA, cyoB, ו frdA עבור מספר משתנה של IBCs במאגר מבודדים בנפרד (n = 1 ניסוי; אחד נקודת ציון הממוצע של משכפל טכני 3). NC = אין שליטה שלילי של ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : שרטוט ותצלומים הקשורים שלה המייצג את ניתוקה של IBCs דרך הפה micropipetting מן נגוע עכברים שלפוחיות. איור זה מתרבה מ Duraiswamy et al.18. (א) A לקצור כל שלפוחית השתן; (B) הפוך כל שלפוחית השתן חושפת את ה-GFP לבטא IBCs; (ג) תקריב של קצה שלפוחית השתן שרוטים מציג IBCs בודדים ההשעיה במאגר סמוכים; (ד) יחידה מבודדת IBC pipetted לתוך צינור. חצים אדומים בחלונית B מציינים דוגמאות GFP-חיוביות IBCs על פני השטח luminal של שלפוחית השתן. קו מקווקו אדום בחלונית C מציין את הגבול הימני של שלפוחית השתן הפוכה (מסומן בתור “BL”); חצים אדומים בחלונית C עולה לכאורה GFP-חיוביות אפיתל תאים בודדים זה שורטת מעל פני השטח שלפוחית השתן. קו מנוקד לבן בחלונית D מציין droplet sub micropipetted-microliter המכיל IBC מבודדים, אשר מסומן על ידי חץ לבן. גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול שתיארנו מאפשר ניתוקה של IBCs יחיד של המודל מאתר של UTI. פרוטוקול זה מבודד IBCs המכיל חיידקים תאיים קיימא, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי culturing עבור CFU. התוצאות פרוטוקול של חיידקים תאיים של IBCs עם מעט זיהום על ידי חיידקים חוץ-תאית, המאפשרות לקדם אפיון של שני חיידקים ולארח התא IBC (איור 4C). אנו גם מראים כי מחיידקים IBC יחיד ניתן להשתמש ביישומים במורד הזרם כגון qPCR (איור 4C), רומז כי הטכניקה שלנו יכול לשמש לתהליך IBCs עבור ניתוחים אחרים במבחנה. על ידי איגוד החיידק שנקטפו מעטים כמו 5 IBCs, בהמשך נדגים את היכולת שלנו לבצע ניתוח לרביעיית-PCR על שלושה גנים חיידקיים, מציע איכות טובה RNA ובביצים החיידק ב שלנו IBCs מבודדים (איור 4D). משולב, הנתונים הראינו מציינים כי ביצוע ניתוח RNA הגנום כולו (כגון רצפי RNA) על יחיד IBCs עשוי להיות אפשרי בעזרת טכניקה זו בידוד.

פרוטוקול זה, לנו יש התמקדו נקודת הזמן 6-אייץ ‘ כי זה כאשר IBC מספרי שיא ב שלפוחיות של עכברים 6 שחור נגוע UTI8927. יתר על כן, גם השתמשנו מערכת התרבות חיידקי סטטי כדי לשפר את הרמה של סוג 1 pilus ביטוי UTI89. הביטוי של pilus מסוג 1 הוא קריטי עבור e. coli לצרף להדביק תאים אפיתל שלפוחית השתן28. עם זאת, ביטוי זה הוא מוסדר בחוזקה29 , רמזים סביבתיים ידועים לשנות אותו30. על מנת לשמור על פנוטיפ זיהום עקבית בעלת מספר מספיק של IBCs, אנו ממליצים על שימוש 2 x 24 h סטטי חיידקי תרבות (מעט שונה Hung ואח8) לבין נקודת זמן זיהום 6-אייץ ‘ בעת עבודה עם בעבר נבדקו e. coli זנים כמו28,NU14, UTI8929. עם זאת, ייתכן כי משתנים אלה צורך להתאימם זנים אחרים UTI או בכל זני עכברים אחרים כדי להשיג את המספר האידיאלי של IBCs של כל זיהום.

בעוד הפרוטוקול מ- Hung ואח8 משתמשת רק נקבות עכברים, פרוטוקולים אחרים הוקמה להקמת זיהום בדרכי השתן בעכברים זכרים כבר דווח על31. במודל זה, דלקת שלפוחית השתן בעכברים זכרים גם בעקבות השביל IBC. כמו שלפוחיות של עכברים הזכר והנקבה דומים בגודלם, אנו צופים כי ניתן להשתמש פרוטוקול הבידוד שלנו IBC על עכברים זכר נגוע גם כן.

הטכנולוגיה פשוטה יחסית מנוצל פרוטוקול זה גם מבטיח כי ניתן לפרוס במעבדות רוב. אחד השלבים המפתח מעורב פרוטוקול זה הוא הוצאת של נימי זכוכית ליצירת microcapillaries על בחירת סוג התא עניין. שלב זה מאפשר גמישות הקוטר של microcapillaries שנוצרו, ולכן השיטה ניתן להרחיב את מספר סוגי תאים מטרה שונים. עם זאת, בשל וריאציית הטמונה ביצירת נימים אלה, יש לנקוט כדי להבטיח הקוטר סופי בטווח שמיש. אם נימי הדם צרים מדי, הם נכשלים לאסוף את התא של עניין, אלא אם הם עשויים רחב מדי, יכול לבחור תאים מרובים בניסיון יחיד. יתר על כן, השימוש של להבה פתוחה במהלך התהליך של משיכת נימי נושא סיכון הטבועה של כוויות, שריפה, אז החוקר מנסה ליצור microcapillaries צריך לטפל כדי למנוע התרחשות אירועים כאלה. כדי להפחית את מידת ההשתנות, כמו גם הסיכון אש פתוחה המעורבים ביצירת נימים אלה, החוקר יכול לעשות שימוש micropipette מסורתיים משיכת מכונה, כגון אלה המשמשים לניסויים אלקטרופזיולוגים (למשל, PC-100, Narishige קבוצה). המכונות האלה עושים שימוש הכובד או פלטפורמות רובוטיות למשוך את נימי הדם, הם ניתן להתאימו לצרכים של המודל זיהום. עם זאת, מגוון רחב של micropipette מושך מכונות זמין פירושה כי החוקר בודדים תצטרך לעבור ניסוי וטעייה כדי לקבוע את הקוטר נימי הסופי המתאים לשימוש עם פרוטוקול זה.

פרוטוקול הציג עושה שימוש של חיידקים לבטא תגית פלורסנט חזותית לזהות את IBC. לפיכך, טכניקה זו הוא מוגבל על ידי היכולת החוקרים שינוי גנטי האורגניזם זיהומיות. במיוחד עבור UPEC, זנים להיוות IBC כגון CFT073 ו- NU14 כבר בהצלחה הפכו עם הבעת-GFP פלסמידים32,33,34; אלה ולכן צריך להיות נגיש באותו הפרוטוקול. מבוסס על האזור של העכבר שלפוחית השתן (70 מ”מ2)35, האורך של תאים אפיתל בודדים (50-120 מיקרומטר)17, וגם את התדירות של IBCs שלפוחית השתן יחיד16, הערכה זהירה על השכיחות של IBCs היא על 1 ב 1,000 תאים (או 0.1%). מהערכה זו מציגה את התועלת של פרוטוקול הבידוד שלנו תא היעד אירועים נדירים. הדיוק של התא הנבחר באמצעות פרוטוקול שלנו מגוון רחב של קטרים נימי זה ניתן למשוך להציע כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד חיידקים תאיים אחרים דגמים ויוו, במבחנה של זיהום. אכן, בהצלחה השתמשנו בטכניקה זו כדי לבודד שלפוחית השתן נגוע בתרבית תאים אפיתל (נתונים לא מוצג).

אחד יותר טכנית מאתגר צעדים בפרוטוקול זה היפוך שלפוחית השתן כדי לחשוף בתאי אפיתל עבור גירוד. מצאנו שזה גם אפשרי לעשות חתך על שלפוחית השתן לפעור את זה עבור גירוד. אולם בשל להקפיד כדי לצמצם את הנזק בתאי אפיתל של שלפוחית השתן במהלך התהליך של חיתוך זה פתוח; אידיאלי חתך אחד צריך להיות מנוצל לפעור פתח שלפוחית השתן. בנוסף, החתך צריכה להיעשות תוך קר הציבורית, כדי למנוע אובדן בשוגג של תאים או רקמה בשלפוחית השתן במהלך התהליך.

הפה pipetting של IBCs ב פרוטוקול זה מספק שליטה רבה יותר על תהליך בחירת תאים, כמו גם הגבלת הנפח הסופי של פתרון הועבר יחד עם התא. שליטה טובה והפרדה גדול של פתרון מפיו החוקרים גם הגדלת הבטיחות של החוקרת, כמו אמצעי האחסון הועבר נמצאים במרחק nanoliter microliter לטווח. לעומת זאת, הניסיון שלנו עם micropipette המודרנית היא כי הוא נוטה להעביר יותר של נוזלים המקיפים תאים עם IBC, שעלול כדי זיהום בחיידקים luminal חוץ-תאית. מציאת שלנו כי הפה pipetting מספק ביצועים גבוהים יותר מעל שאר תא בודד שיטות בידוד גם דווחה על-ידי אחרים מעבדות22,23,24. מלבד בידוד תא בודד, הפה pipetting אפילו כבר בשימוש אלקטרופורציה תא בודד של נוירונים25, אשר בהמשך מדגים השירות והפקד דקה חוקר מיומן יכול להשיג עם הטכניקה. עם זאת, בטיחות ישנה חשיבות רבה, אנו מציעים פוטנציאליים לנקוט צעדים נוספים שניתן לנקוט בהתאם פתוגנים בשימוש: (i) ההרחבה של המאגר אוויר בין החוקר לבין החומר הביולוגי, לדוגמה על-ידי שימוש כ רפה בעברית פיפטה עם נפח גדול (למשל, 5 מ ל), או (ii) הוספת מסנן פיזי כמו צמר גפן לתוך פיפטה שואבת לשמש מכשול נוסף.

במקרים שבהם הערכת סיכונים מוביל למסקנה כי הפה pipetting הוא עדיין מסוכן מדי, זמינים מסחרית setups רובוטית (כגון אלה שימשו nanoinjections) יכול להיות משולב עם סעיפים אחרים של הטכניקה שלנו כדי לספק שיטה בטוחה יותר בידוד תאים נגועים של אוכלוסיות מעורבות. יצוין כי הניסיון שלנו עם שימוש של micromanipulator רובוטית הוכיח שיעור מופחת של בידוד IBC בהשוואה הפה pipetting, כמו וריאציה התוך ניסיוני גדול בגודל תאים אפיתל שלפוחית השתן הופך אותו מאתגרת עבור המשתמש של זרוע רובוטית כדי לקבוע את הכוח הנדרש כדי לאסוף IBCs יחיד. למרות זאת, נותר אופציה בת קיימא, למרות costlier, אלה שעבדו עם סוכנים מאוד מדבקת של המחלה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר הלאומי, משרד, סינגפור ראש הממשלה, תחת שלה ערכה מלגת מחקר ה-NRF (ה-NRF פרס. לא. NRF-RF2010-10); סינגפור משרד הבריאות של המועצה הלאומית למחקר רפואי (NMRC/ספר הנהלים/1358-2013); מכון הגנום של סינגפור (GIS) / הסוכנות לענייני מדע, טכנולוגיה, מחקר (A * כוכב).

Materials

1.5ml eppendorf tube For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol For Alcohol Burner
15 ml conical tube For static bacterial culture and OD measurement
1ml Tuberculin Syringe BD Biosciences  302100
3% Bacterial Agar For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps Braun/Kruuse BD222R For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner Wheaton 237070
Aspirating pipette BD Biosciences  357558
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177
Bacterial loops For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge Eppendorf 5424 Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope Olympus DP71 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries Kimax 6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM Braun BC110R
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein Animal Health 29405
Kanamycin Sulfate Calbiochem 420311 For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller) Thermo/Gibco 10855021 For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope Olympus LG-PS2 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant  KY Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope Olympus MVX10 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing BD Intramedic 427401
Precision Glide needle 30G BD Biosciences  305107 Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved Braun BD312R
Spray bottle (for ethanol) For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes Elkay 127-1010-400 For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet Baker SG403 Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish Thermo 101VR20 Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm Braun OK366R Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM Braun BC320R
Tabletop Centrifuge Eppendorf 5810R Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter Biowave (Biochrom) 80-3000-45 For static bacterial culture and OD measurement
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  2. Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
  3. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
  4. Foxman, B., Barlow, R., D’Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
  5. Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
  6. Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
  7. Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
  8. Hung, C. -. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
  9. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
  10. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
  11. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
  12. Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
  13. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
  14. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  15. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  16. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
  17. Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
  18. Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
  19. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
  20. Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
  21. Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
  22. Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
  23. Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
  24. Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
  25. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).
  26. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
  27. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  28. Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
  29. Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
  30. Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
  31. Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
  32. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  33. Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
  34. Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
  35. Jost, S. P. Postnatal growth of the mouse bladder. Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).

Tags

Intracellular Bacterial CommunitiesIBCsUrinary Tract InfectionUTIMouse BladderMouth MicropipettingGlass Capillary TubeBladder Epithelial CellsSingle-cell Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yang, E., Chee, J. L., Duraiswamy, S., Chen, S., Lees, K., Chen, S. L. Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis. J. Vis. Exp. (146), e58829, doi:10.3791/58829 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image