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Immunology and Infection

Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/58804
, , , , , , , , , , , ,
1Graduate School of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research,National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology,Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology,National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases,Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE,Hokkaido University, 9Department of Immunology,National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba

Summary

Qui, descriviamo i protocolli per l’analisi e la visualizzazione della struttura e costituzione di repertori di anticorpo intero. Ciò comporta l’acquisizione di vaste sequenze di RNA di anticorpo usando il sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

L’immenso adattabilità del riconoscimento dell’antigene da anticorpi è la base del sistema immunitario acquisito. Nonostante la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base della produzione del vasto repertorio di anticorpi dai sistemi immunitario acquisiti, non ancora e ‘ stato possibile arrivare a una visione globale di un repertorio completo dell’anticorpo. In particolare, repertori delle cellule di B sono stati considerati come una scatola nera a causa del loro numero astronomico di cloni di anticorpo. Tuttavia, tecnologie di sequenziamento di nuova generazione consentono innovazioni aumentare la nostra comprensione del repertorio delle cellule di B. In questo rapporto, descriviamo un metodo semplice ed efficace per visualizzare e analizzare interi singoli mouse e repertori di anticorpo umano. Da organi immuni, rappresentativo da milza nei topi e cellule mononucleari del sangue periferico in esseri umani, RNA totale era preparato, inverso trascritto e amplificato utilizzando il metodo di 5’-RACE. Per i domini costante di anticorpi specifici della classe, utilizzando un primer universale avanti e primer antisenso, anticorpo mRNA sono stati amplificati uniformemente in proporzioni che riflettono le loro frequenze nelle popolazioni dell’anticorpo. Gli ampliconi sono stati sequenziati di sequenziamento di nuova generazione (NGS), producendo più di 105 sequenze di anticorpo per campione immunologico. Descriviamo i protocolli per l’analisi di sequenza dell’anticorpo tra cui annotazione di V (D) J-gene-segmento, una vista panoramica del repertorio di anticorpi e i nostri metodi computazionali.

Introduction

Il sistema di anticorpo è uno dei fondamenti del sistema immunitario acquisito. È altamente potente contro l’invasione di agenti patogeni grazie alla sua grande diversità, la specificità dell’antigene fine del riconoscimento e l’espansione clonale delle cellule di B di antigene-specifiche. Il repertorio di cellule produttrici di anticorpi B è stimato a più di 1015 in un singolo individuali1. Questa immensa diversità viene generata con l’aiuto di ricombinazione di gene VDJ in immunoglobulina loci genetici2. Descrizione dei repertori intero delle cellule di B ed i loro cambiamenti dinamici in risposta all’antigene-immunizzazione pertanto è impegnativo, ma essenziale per una completa comprensione della risposta dell’anticorpo contro agenti patogeni d’invasione.

A causa della loro diversità astronomico, repertori delle cellule di B sono stati considerati come una scatola nera; Tuttavia, l’avvento della tecnologia NGS ha consentito scoperte per una maggiore comprensione della loro complessità3,4. Repertori di anticorpo intero sono stati analizzati con successo, in primo luogo in zebrafish5, poi6topi e gli esseri umani6,7. Anche se NGS è ormai diventata un potente strumento nello studio della risposta immunitaria adattativa, analisi di base delle comunanze e differenze in repertori di anticorpo tra singoli animali sono carenti.

Nei topi, è stato riferito che i repertori di IgM sono quasi identici tra individui, mentre quelle di IgG1 e IgG2c sono sostanzialmente diversi tra individui8. Oltre al profilo di utilizzo del gene V, la frequenza osservata di VDJ-profilo in cellule di B ingenui periferiche è altamente simile tra individui8. L’analisi delle sequenze dell’amminoacido della regione VDJ inoltre ha mostrato l’avvenimento delle stesse sequenze giunzionale in diversi topi molto più frequentemente di precedentemente pensiero8. Questi risultati indicano che i meccanismi per la formazione del repertorio anticorpale possono essere deterministiche anziché stocastici5,8,9. Il processo di sviluppo di repertorio dell’anticorpo in topi è anche stato analizzato con successo utilizzando NGS per evidenziare ulteriormente il potenziale di NGS per scoprire le difese immunitarie anticorpo in dettaglio10.

In questo rapporto, descriviamo un metodo semplice ed efficace per visualizzare e analizzare un repertorio di anticorpo a livello globale.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali e con l’approvazione del Comitato di uso e National Institute di infettive malattie cura degli animali. Campionamento di PBMCs da volontari adulti sani, utilizzato come il risultato rappresentativo in questo rapporto, è stata eseguita con l’approvazione del comitato etico dell’Istituto nazionale di malattie infettive, Tokyo, Giappone e scritto consenso informato è stato ottenuto da ciascun partecipante utilizzando un modulo approvato dal comitato di etica. 1. primer Design Progettare un primer universale avanti al cDNA per amplificare l’immunoglobulina mRNA senza pregiudizi da iniettori di PCR, come usato nel 5′-RACE11,12 e SMART-PCR13 tecniche. Per l’amplificazione del gene dell’immunoglobulina VH, progettare le sequenze specifiche della classe di immunoglobulina della regione costante come iniettori d’inversione8,14 (Figura 1A).Nota: Sequenze di Multiplex tag possono essere aggiunti a qualsiasi di questi primer per etichettare le molecole di libreria da diverse sorgenti di campionamento. Sequenze per PCR annidata possono anche aggiungersi, secondo il manuale del kit utilizzato15. Primer universale in avanti 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ Iniettori d’inversione per le immunoglobuline del mouse (Rif. 8) IgM_CH1: 5′-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 ‘ IgG1_CH1: 5’-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 ‘ IgG2c_CH1: 5’-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 ‘ IgG3_CH1: 5′-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3′ IgA_CH1: 5′-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3′ Igκ_CH1: 5’-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 ‘ Igλ_CH1: 5’-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 ‘ Iniettori d’inversione per le immunoglobuline umane (Ref.14) IgM_CH1: 5’-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 ‘ IgG_CH1: 5’-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 ‘ IgD_CH1: 5’-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 ‘ IgA_CH1: 5’-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 ‘ IgE1_CH1: 5’-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 ‘ IgE2_CH1: 5’-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 ‘ Igκ_CH1: 5’-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 ‘ Igλ_CH1: 5’-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 ‘ Tabella 1: Sequenze di Primer per l’amplificazione di PCR delle immunoglobuline 2. acido nucleico isolamento dai tessuti e cellule del sistema immunitario Nota: La procedura di seguito descritta è per l’estrazione di acidi nucleici dalla milza del mouse. Tuttavia, è applicabile ad altri immuni tessuti e cellule umane come linfonodi o cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) (Figura 1B). Sezionare il tessuto, per esempio, milza da un mouse C57BL/6 8-settimana-vecchio e passarlo attraverso una maglia di acciaio inox (da 200 a 400 µm) con 2 mL di tampone PBS per ottenere cellule disperse. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL e centrifugare per 5 min 600 × g e 4 ˚ c. Scartare il surnatante. Aggiungere 800 µ l di tampone lisante ACK (150mm NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7,2) il pellet e incubare in ghiaccio per 2 min a lisare eritrociti nel tessuto. Lavare le cellule del tessuto con 2 mL di PBS 3 x, seguita da centrifugazione per 5 min a 600 × g e 4 ˚ c. Aggiungere 800 µ l di fenolo/guanidina isotiocianato reagente al pellet, vortice accuratamente e incubare a circa 25 ˚ c per 5 min. Aggiungere cloroformio (200 µ l), agitare manualmente per 15 s e poi incubare per 2 min a circa 25 ˚ c. Separare le fasi di centrifugazione per 15 min a 12.000 × g e 25 ˚ c e la fase acquosa superiore di trasferimento in una nuova provetta. Aggiungere un volume di etanolo al 70%, vortex brevemente e applicarlo alla colonna di spin di silice. Eluire il RNA con 30 – 100 µ l di acqua. Quantificare la concentrazione di RNA iniziale utilizzando un fluorimetro (Tabella materiali). Memorizzare il RNA purificato a-80 ˚ c. 3. sintesi del cDNA e l’amplificazione di PCR Nota: Il metodo descritto di seguito si basa sulla 5′-RACE11,12 e SMART-PCR tecniche13. I dettagli e l’ottimizzazione della reazione sono descritte nel manuale del kit 15. I materiali di partenza per l’immunoglobulina del mouse sono il campione dal punto 2.10. I materiali di partenza per l’immunoglobulina umana sono il campione da tessuti umani, es. PBMC, trattato come descritto nei passaggi da 2.3 a 2.10. Sintetizzare cDNA del primo-filo da 2 a 10 µ g di modello di RNA totale usando primer di CD di 5’-RACE (oligo-dT-contenente) e oligonucleotide di SMART-PCR (Tabella materiali) secondo istruzioni15 del produttore. Per l’immunoglobulina di topo, PCR-amplificare il cDNA con alta fedeltà DNA polimerasi usando il primer forward universale e iniettori d’inversione specifiche della classe di immunoglobuline (tabella 1). Impostare le condizioni termiche in bicicletta come: 94 ° c per 2 min, poi 40 cicli di 94 ° c per 30 s, 59 ˚ c per 30 s e 72 ° c per 30 s, seguita da una fase di estensione finale a 72 ° c per 5 min.Nota: Tipici esperimenti amplificano classi di immunoglobuline IgM, IgG1, IgG2c, Igk e Igl a guardare l’ingenuo, Th1-dipendente e cellule Th2-dipendente B (Figura 3). Per l’immunoglobulina umana, eseguire il 1st PCR utilizzando i primer forward universale e iniettori d’inversione specifiche della classe di immunoglobuline (tabella 1) con sequenze di tag. Includere le sequenze di indice per ogni campione da 2nd PCR utilizzando primers sequenza indice. Utilizzare le seguenti condizioni PCR e la polimerasi di Taq: 94 ° c per 2 min, 21 cicli (1st PCR) o 32 cicli (2nd PCR) a 94 ° c per 30 s, 59 ˚ c per 30 s, 72 ° c per 30 s.Nota: Tipici esperimenti amplificano IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ed IgG4), IgA (IgA1 e IgA2), classi di immunoglobuline IgE, Igk e Igl a guardare tutte le popolazioni di cellule B (Figura 4). Electrophorese i prodotti di PCR su un gel di agarosio e purificare frammenti di bp di 600-800 utilizzando una membrana spin-colonna di silice. Electrophorese il campione da 3.2.1 o 3.2.2 su gel di agarosio al 2%. Visualizzare le bande di DNA su transilluminatore UV e asportare la fetta di gel contenente la banda larga tra 600 e 800 bp. Aggiungere 10 mL di soluzione di associazione di membrana per 10 mg di fetta di gel. Mescolare e incubare a 50 – 65 ° C fino a quando la fetta di gel è completamente sciolto. Trasferire la soluzione di gel di silice membrana spin-colonna. Lavare una volta con tampone di lavaggio ed eluire il DNA con 50 mL di acqua priva di nucleasi (Tabella materiali). Quantificare gli ampliconi purificati con un fluorimetro e piscina ampliconi di ogni codice categoria dell’immunoglobulina in quantità uguali per il sequenziamento NGS.Nota: In genere, 2-10 mg amplicone DNA è stato recuperato per ogni classe di immunoglobuline. Mescolare ogni soluzione campione ugualmente in quantità di DNA per dare aumento 50 mL soluzione contenente 10-20 ng DNA/mL. Determinare la dimensione e la concentrazione di librerie utilizzando un micro-capillare base elettroforesi con chip a DNA dimensionamento (Tabella materiali). Memorizzare le librerie a – 20 ° C. 4. NGS sequenziamento delle biblioteche Generare un SampleSheet.cvs per il sequenziamento esecuzione specificando nome di esempio, informazioni sull’indice e istruire per ottenere solo i file. fastq. Scongelare la cartuccia di reagente (Tabella materiali) e le librerie. Fare 0,2 N NaOH e diluire le librerie per ottenere la concentrazione molare desiderata. Sciacquare e asciugare la cella di flusso. Aggiungere 600 mL di soluzione diluita e denaturato library nel pozzo della cartuccia del reagente. Avviare l’esecuzione di sequenziamento. 5. controllo di qualità di dati NGS Eseguire il controllo di qualità dei dati FASTQ usando il “FASTX-Toolkit”16.Nota: Un esempio di base delle impostazioni parametro utilizzato è la seguente:fastq_quality_trimmer – v -t 20 – l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastq_quality_filter – v – q 20 – p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastx_reverse_complement – v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] Formattare i file di output su “fasta dell’acido nucleico (.fna)” con il seguente comando:fastq_to_fasta – v – n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna] 6. estrazione e analisi delle sequenze di immunoglobulina da .fna dati Nota: I programmi di esempio sono stati implementati in ambiente UNIX. Si prega di usarli come un esempio riferimenti perché prestazioni variano in base al sistema operativo e ambiente hardware. Gli autori non accettano alcuna responsabilità per errori od omissioni. I linguaggi di programmazione, Perl17, R18e moduli necessari devono essere installati secondo le istruzioni sui siti Web citati. il programma di IgBLAST devono essere installati secondo le istruzioni sul sito Web appropriato19,20. Scaricare i seguenti esempi di programmi interni per le analisi di repertorio da https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:03_PipeLine_Mouse.zip; Un insieme di programmi di esempio per l’analisi delle sequenze dell’anticorpo del mouse.05_PipeLine_Human.zip; Un insieme di programmi di esempio per l’analisi delle sequenze di anticorpo umano. Estratto l’anticorpo legge i dati di sequenza: estrarre le sequenze dell’immunoglobulina (Ig) di ogni classe di Ig (.fna) dati da un programma in Perl che cerca le sequenze di firma in ogni regione costante dell’immunoglobulina (tabella 2). Per i geni della catena pesante (IgH) dell’immunoglobulina del mouse, è possibile estrarre le letture con il seguente comando:$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [nome file di Input] [nome file di Output (suffisso)] Per la catena chiara dell’immunoglobulina di topo (IgL) geni estrarre le letture con il seguente comando:$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [nome file di Input] [nome file di Output (suffisso)] Per i geni della catena pesante (IgH) immunoglobulina umana, estrarre le letture con il seguente comando:$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [nome file di Input] [nome file di Output (suffisso)] Per i geni di catena leggera (IgL) di immunoglobulina umana, estrarre le letture con il seguente comando:$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [nome file di Input] [nome file di Output (suffisso)] Annotare e controllare la produttività di ricombinazione di V (D) J gene:Nota: Il metodo descritto di seguito utilizza standalone IgBLAST19 per l’annotazione di segmenti nella sequenza del gene di V (D) J. Impostare il database per i geni di V (D) J e le impostazioni dei parametri per IgBLAST come descritto20. Annotazione dei geni della catena pesante (IgH) dell’immunoglobulina del mouse con il seguente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organismo del mouse – domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Annotazione dei geni della catena leggera (IgL) dell’immunoglobulina del mouse con il seguente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organismo del mouse – domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Annotare i geni della catena pesante (IgH) immunoglobulina umana con il seguente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organismo umano – domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Annotare i geni di catena leggera (IgL) di immunoglobulina umana con il seguente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organismo umano – domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Visualizzare la funzione globale di un repertorio di anticorpo. Visualizzare il repertorio di IgH del mouse con il seguente comando:$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.shNota: Il file di input è filename.fna (dati di sequenza), preferibilmente il file di output da 6.2.1. Questo file deve essere collocato in una directory inferiore (cartella) chiamata “nomefile”. In linea 50 dello script della shell, è possibile assegnare un “nomefile” per Para_4. Visualizzare il repertorio di IgH umano con il seguente comando:$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.shNota: Il file di input è filename.fna sequenza dati, preferibilmente il file di output di 6.2.3. Questo file deve essere posizionato nella directory inferiore (cartella) che il nome è “nomefile”. Nella riga 46 dello script della shell, è possibile assegnare un “nomefile” per Para_4. Visualizzare il repertorio di IgL del mouse con il seguente comando:$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.shNota: Con questa pipeline, Igk e Igl vengono elaborati simultaneamente. Il file di input è filename.fna (dati di sequenza), preferibilmente il file di output da 6.2.2. Questo file deve trovarsi nella directory inferiore (cartella) denominata “nomefile”. Nella linea 53 dello script della shell, è possibile assegnare un “nomefile” per Para_4. Nome del file di output, che termina con “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” dà le coordinate per un grafico a barre bidimensionale (Figura 3, IgL). Visualizzare il repertorio IgL umano con il seguente comando:$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.shNota: Con questa pipeline, Igk e Igl vengono elaborati simultaneamente. Il file di input è filename.fna sequenza dati, preferibilmente il file di output di 6.2.4. Questo file deve essere collocato in una directory inferiore (cartella) chiamata “nomefile”. Nella linea 53 dello script della shell, è necessario assegnare “nomefile” per Para_4. Il nome del file di output che terminano con “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” dà le coordinate per un grafico a barre bidimensionale (Figura 4, IgL).

Representative Results

Repertori dell’anticorpo del mouse Una prospettiva di un repertorio di anticorpo murino nel suo complesso può essere ottenuta da cellule o tessuti quali la milza, midollo osseo, linfonodo o sangue. La figura 3 Mostra risultati rappresentativi di IgM, IgG1, IgG2c e immunoglobulina repertori di catena leggera (IgL) da una milza di topo ingenuo. Il riepilogo dei numeri letti è mostrato nella tabella 3. Ad esempio, 166.175/475.144 letture contenuto IgM specifiche firma sequenza (tabella 2) e letture di 133.371/166.175 erano VDJ-produttivo dedotto dal IgBLAST19. La figura 3 Mostra un profilo di repertorio di VDJ-riarrangiamento di 3D-VDJ-trama, in cui la dimensione di ogni sfera rappresenta il numero relativo di letture; in altre parole, il numero di mRNA dell’anticorpo in tutta B cellule. La mesh 3D è composto da 110 IGHV, IGHD 12 e 4 IGHJ, che sono stati allineati in modo da riflettere il loro ordine sul cromosoma. Inoltre, i geni ambiguamente assegnati da IgBLAST sono stati raccolti separatamente in ultima posizione per ogni linea IGHV, IGHD e IGHJ, dando origine a 7.215 nodi il cuboid. Inoltre, è indicato nella Figura 3 è una 2D-VJ-trama mostrando il profilo di VJ-riorganizzazione nel repertorio IgL. La lunghezza di ogni barra su questo terreno rappresenta il numero relativo di letture. L’asse x rappresenta 101 IGLVκ e 3 geni IGLVλ, e l’asse y rappresenta IGLJκ 4 e 3 geni IGLJλ. Gli annotate V-J-geni e sono rappresentati al limite destro. La regione dideterminazione 3 (CDR3) sequenze di queste letture produttive, che danno luogo alla maggior parte delle specificità antigene-legante, sono date in IgBLAST uscite. CDR3 sequenze possono essere analizzate statisticamente, tra cui repliche biologiche o tecniche, come descritto in precedenza8,10. Repertori di anticorpo umano Una prospettiva di un repertorio di anticorpo umano nel suo complesso può essere analizzata da vari tessuti comprese le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o tessuti patologici. La figura 4 Mostra i risultati rappresentativi di IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ed IgG4) di totale, totale IgA (IgA1 e IgA2), IgD, IgE e IgL repertori da PBMCs normale. Un riepilogo dei numeri letti è mostrato nella tabella 3. Ad esempio, 90.238/1.582.754 letture contenuto IgM specifiche firma sequenza e 67.896/90.238 letture erano VDJ-produttivi. Il profilo di repertorio del riarrangiamento VDJ è mostrato su un 3D-VDJ-terreno in cui la dimensione di ogni sfera rappresenta il numero relativo di letture; in altre parole, il numero dei mRNAs anticorpo da PBMCs intero (Figura 4). La mesh 3D è costituito da 56 IGHV, 27 IGHD e IGHJ 6, allineate in ordine in cui appaiono sul cromosoma. Inoltre, geni ambiguamente assegnati da IgBLAST sono rappresentate separatamente in ultima posizione per ogni linea IGHV, IGHD e IGHJ, dando origine a 11.172 nodi il cuboid. Il profilo di VJ-riorganizzazione nel repertorio IgL è raffigurato in una 2D-VJ-trama in cui la lunghezza di ogni barra rappresenta il numero relativo di letture (Figura 4). L’asse x rappresenta 32 IGLVλ geni e 41 IGLVκ, e l’asse y rappresenta IGLJκ 5 e 5 geni IGLJλ. L’ONU-V – e J-geni annotati sono rappresentati al limite destro. Le sequenze di CDR3 umane sono indicate in IgBLAST uscite e possono essere analizzati statisticamente come descritto in precedenza8,10. Codice categoria dell’immunoglobulina Senso Antisenso Catene pesanti dell’immunoglobulina di topo (C57BL/6) IgM AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC GACATTTGGGAAGGACTGACT IgG1 AAAACGACACCCCCATCTGTC GACAGATGGGGGTGTCGTTTT (Variante di IgG1) AAAACAACACCCCCATCAGTC GACTGATGGGGGTGTTGTTTT IgG2c AAAACAACAGCCCCATCGGTC GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgG3 GTGATCCCGTGATAATCGGCT AGCCGATTATCACGGGATCAC IgA TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG Catene chiare dell’immunoglobulina di topo (C57BL/6) Igκ CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG Igλ1 TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ2 TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ3 TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA Igλ4 TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA Catene pesanti dell’immunoglobulina umana IgM GGGAGTGCATCCGCCCCAAC GTTGGGGCGGATGCACTCCC IgG GCTTCCACCAAGGGCCCATC GATGGGCCCTTGGTGGAAGC IgA GCATCCCCGACCAGCCCCAA GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgD GCACCCACCAAGGCTCCGGA TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC IgE GCCTCCACACAGAGCCCATC GATGGGCTCTGTGTGGAGGC Catene chiare dell’immunoglobulina umana Igκ ACTGTGGCTGCACCATCTGC GCAGATGGTGCAGCCACAGT Igλ1, 2, 6 GTCACTCTGTTCCCGCCCTC GAGGGCGGGAACAGAGTGAC Igλ3, 7 GTCACTCTGTTCCCACCCTC GAGGGTGGGAACAGAGTGAC Tabella 2: Riassunto delle sequenze firma dell’immunoglobulina IgH mouse Totale letture IgM IgG1 IgG2c Ingresso 475.144 CIG-contenenti 166.175 229.671 36.628 VDJ-produttivo 133.371 196.583 31.446 IgL mouse Totale letture IgKappa Igkappa Ingresso 527.668 CIG-contenenti 178.948 21.446 VJ-produttivo 160.924 16.988 IgH umano Totale letture IgM IgG IgA IgD IgE Ingresso 1.582.754 CIG-contenenti 90.238 5.298 94.061 75.549 2.932 VDJ-produttivo 67.896 2.775 78.203 56.495 3 IgL umano Totale letture IgKappa Igkappa Ingresso 1.582.754 CIG-contenenti 120.316 64.148 VJ-produttivo 97.169 52.324 Tabella 3: Riassunto dei numeri letti negli esperimenti Figura 1: rappresentazione schematica della strategia per il sequenziamento per l’analisi dei repertori dell’anticorpo in topi individuali. (A) totale RNA da cellule immunitarie o dei tessuti era retrotrascritto e PCR-amplificato utilizzando il primer forward universale e specifico della classe immunoglobulina reverse primer. Gli ampliconi di ogni codice categoria dell’immunoglobulina sono stati riuniti ed eseguito il rendering per il sequenziamento di nuova generazione. (B) il biologico replica come milze da topi C57BL/6 sono state trattate come segue: RNA totale sono state purificate da campioni di milza e cDNA sono stati amplificati da 5′-RACE utilizzando il primer universale e anticorpi specifici della classe primer. Quindi fossero resi per il sequenziamento di nuova generazione con etichettatura primer per topi individuali. Parti della figura sono adattati da8 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: schematico di elaborazione dati diagramma di flusso per l’analisi dei repertori dell’anticorpo in topi individuali. Letture di ampliconi ottenute dopo sequenziamento di nuova generazione sono state elaborate come segue: (1) sequenze di lettura sono stati controllati per la presenza di anticorpi specifici della classe firma sequenze; (2) sequenze sono stati esaminati per il V, D, e gene J frammenti usando IMGT/HighV-Quest e/o IgBLAST; (3) le sequenze contenenti una giunzione VDJ produttiva sono stati raccolti; e (4) queste sequenze sono state usate per l’analisi delle caratteristiche complessive del repertorio, CDR3, ecc Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: visualizzazione dei dati globali per repertori dell’anticorpo del mouse. I profili di repertorio generale di ogni classe dell’anticorpo sono stati visualizzati da 3D-VDJ-trama. L’asse x rappresenta 110 geni IGHV ordinati come sul cromosoma. il y – e z asse rappresenta IGHD 12 e 4 geni IGHJ, rispettivamente. Il volume delle sfere su ogni nodo rappresenta il numero di letture. Sfere rosse: annullare l’annotazione geni V, D e J. La IgL leggere distribuzioni sono mostrati su un 2D-VJ-terreno in cui la lunghezza di ogni barra rappresenta il numero relativo di letture. Rappresenta l’asse x 101 x 3 geni di x IGLVλ e IGLVκ, e l’asse y rappresenta 4 x 3 geni di x IGLJλ e IGLJκ. I geni V e J annullare l’annotazione sono rappresentati al limite destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: visualizzazione dei dati globali per repertori di anticorpo umano. I profili di repertorio generale di ogni classe dell’anticorpo sono stati visualizzati da 3D-VDJ-trama. L’asse x rappresenta 56 geni IGHV ordinati come sul cromosoma. il y – e z asse rappresenta IGHD 27 e 6 geni IGHJ, rispettivamente. Il volume delle sfere su ogni nodo rappresenta il numero di letture. Sfere rosse: annullare l’annotazione geni V, D e J. Le letture di IgL sono schierate su 2D-VJ-terreno in cui la lunghezza di ogni barra rappresenta il numero relativo del legge. Rappresenta l’asse x 41 x 32 x IGLVλ geni e IGLVκ, e l’asse y rappresenta 5 x 5 geni di x IGLJλ e IGLJκ. L’ONU-V – e J-geni annotati sono rappresentati al limite destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il metodo qui descritto utilizza NGS per l’anticorpo RNA amplificato utilizzando il metodo di 5′-RACE. Contrariamente ai metodi che utilizzano gli iniettori degenerati 5′-VH gene, mRNA di ciascuna classe di anticorpo è amplificati in modo uniforme utilizzando universal primer in avanti. Inoltre, l’utilizzo di primer antisenso specifici per la costante-regione 1 (CH1) del gene dell’anticorpo consente repertorio profilatura delle classi di immunoglobuline specifiche. Questo è molto utile per la risposta degli anticorpi specifici della classe di dissezione, così come per il confronto di ingenuo e repertori immunizzati8,9.

Un trabocchetto più probabile del metodo è una scarsità dei messaggi di immunoglobulina amplificato. La profondità del repertorio di anticorpi ottenuto dal presente protocollo sostanzialmente dipende l’amplificazione di PCR descritto ai punti 3.1 e 3.2. Se non si ottiene correttamente la profondità di repertorio, cambiando i rapporti di modello cDNA e primer a punti 3.2.1 o 3.2.2 è fortemente raccomandato.

In generale, circa il 20% delle letture dell’anticorpo prodotte da NGS sono sequenze ambiguo21. “Metodi di correzione”, stabilito anche con 5-10% rimangono ambigui3. Abbiamo, quindi, analizzato la sequenza e filtrata crude letture contenenti sequenze di firma corrispondenti alle regioni costante dell’immunoglobulina (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, ecc.). Da qui l’analisi della iper-mutazioni somatiche deve gli esami attenti.

Una delle limitazioni di questo metodo è quello pesante dell’immunoglobulina e coppia di catena leggera è in grado di dedurre. Da qui la vista di repertorio ottenuta con tale metodo non è olistica. Tuttavia, è possibile approssimare le coppie di alto livello di analisi statistica dei dati10. Inoltre, un metodo novello per sequenza le coppie di immunoglobulina è stato recentemente segnalato3,4.

Le sequenze di immunoglobulina nei dati di .fna d’uscita sono stati estratti basato sulla presenza di sequenze di firma del gene dell’immunoglobulina. Il gene V, D e J segmenti sono stati quindi annotati e la produttività delle riorganizzazioni di V (D) J sono stati valutati. La regione dideterminazione 3 (CDR3) sequenze annotate anche. Questi esami sistematici delle sequenze dell’immunoglobulina in .fna dati utilmente sono stati forniti da di IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Tuttavia, costruzione di una pipeline di elaborazione automatizzata ha il merito di analizzare i dati sperimentali grandi. La pipeline personalizzata per ogni scopo è possibile impostare utilizzando la standalone IgBLAST protocollo19. Questo approccio ha bisogno di alfabetizzazione di base programmazione ma è molto utile per un’analisi dettagliata del sistema dell’immunoglobulina. Le condotte descritte sono gli esempi del protocollo personalizzato (Figura 2).

Il numero di anticorpi di legge è proporzionale alla quantità di anticorpo RNAs nel campione, riflettendo i costituenti dell’anticorpo del sistema dell’anticorpo a dato tempo punti5,8,25. Il metodo qui descritto dà una vista aerea della costituzione di un repertorio di anticorpo usando R programmi8,18,26V (D) J.

La visione globale dei repertori di anticorpo IgM di singoli ingenuo topi ha rivelato un profilo di VDJ altamente conservato rispetto a quelli delle IgG1 o IgG2c8. È stato riferito che VDJ combinazioni di zebrafish immaturi sono altamente stereotipata9. Al contrario, combinazioni di VDJ umani sono segnalati per essere altamente distorta6. Gli altamente conservati deterministici VDJ-profili in cellule di B ingenui sono probabilmente sia generata dalle distorte VDJ-riorganizzazioni o negativa selezione con auto-antigeni presentati nel corpo. Ad esempio, IGHV11-2 è espresso preferenzialmente nel fetale IgM repertorio27 e questa predominanza è attribuita a autoreactivity di IGHV11-2 contro gli eritrociti senescenti27. È interessante notare che, IGHV11-2 è stata anche il repertorio principale più comune nella nostra analisi precedentemente pubblicati di ingenui IgM8.

Il metodo qui descritto è utile per decifrare repertori anticorpo antigene-sensible a reagire analizzando complessivamente lo spazio di anticorpo-repertorio generato in singoli corpi, evitando l’eventuale omissione di anticorpo chiave repertori8, 10. Questo metodo permette anche l’esame del dinamismo di rete dettagliate dell’anticorpo, che agevolerebbe accelerato individuazione di anticorpi protettivi contro emergenti patogeni.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione AMED sotto Grant numero JP18fk0108011 (KO e SI) e JP18fm0208002 (TS, KO e YO) e una sovvenzione dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (15K 15159) per KO. Ringraziamo Sayuri Yamaguchi e Satoko Sasaki per la preziosa assistenza tecnica. Vorremmo ringraziare Editage (www.editage.jp) per la modifica di lingua inglese.

Materials

0.2 mL Strip Tubes Thermo Fisher Scientific AB0452 120 strips
100 bp DNA Ladder TOYOBO DNA-035 0.5 mL
2100 Bioanalyzer Systems Agilent Technologies G2939BA /2100
Acetic Acid Wako 017-00256 500 mL
Agarose, NuSieve GTG Lonza 50084
Ammonium Chloride Wako 017-02995 500 g
Chloroform Wako 038-02606 500 mL
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” NISSUI  08192
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) Wako 345-01865 500 g
Falcon 40 µm Cell Strainer Falcon 352340 50/Case
ling lock tube 1.7 mL BM EQUIPMENT BM-15
ling lock tube 2.0 mL BM EQUIPMENT BM-20
MiSeq Reagent Kit v2 illumina MS-102-2003 500 cycles
MiSeq System illumina SY-410-1003
NanoDrop 2000c Spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
Potassium Hydrogen Carbonate Wako 166-03275 500 g
PureLink RNA Mini Kit life technologies 12183018A
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 500 assays
SMARTer RACE 5’/3’ Kit  Clontech  634858
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version  Takara Bio Inc.  RR006A 
Trizma base Sigma T6066 1 kg
TRIzol Reagent AmbionThermo Fisher Scientific 15596026 100 mL
Ultra Clear qPCR Caps Thermo Fisher Scientific AB0866 120 strips
UltraPure Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega  A9282
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References

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Sun, L., Kono, N., Toh, H., Xue, H., Sano, K., Suzuki, T., Ainai, A., Orba, Y., Yamagishi, J., Hasegawa, H., Takahashi, Y., Itamura, S., Ohnishi, K. Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (145), e58804, doi:10.3791/58804 (2019).
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