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Immunology and Infection

Identificación de ratón y anticuerpos humanos repertorios por secuenciación de próxima generación

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/58804
, , , , , , , , , , , ,
1Graduate School of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research,National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology,Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology,National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases,Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE,Hokkaido University, 9Department of Immunology,National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba

Summary

Aquí, describimos protocolos para el análisis y visualización de la estructura y Constitución de los repertorios de anticuerpos todo. Se trata de la adquisición de grandes secuencias de RNA anticuerpos mediante secuenciación de próxima generación.

Abstract

La inmensa capacidad de adaptación de reconocimiento del antígeno por anticuerpos es la base del sistema inmunitario adquirido. A pesar de nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a la producción del gran repertorio de anticuerpos por el sistema inmunológico adquirido, ha no todavía sido posible llegar a una visión global de un repertorio de anticuerpos completos. En particular, los repertorios de células B han sido considerados como una caja negra debido a su astronómico número de clones de anticuerpo. Sin embargo, tecnologías de secuenciación de próxima generación están permitiendo avances para aumentar nuestra comprensión del repertorio de células B. En este informe, describimos un método simple y eficaz para visualizar y analizar todo individual ratón y repertorios de anticuerpos humanos. De los órganos inmunes, representativo del bazo de los ratones y las células mononucleares de sangre periférica en humanos, ARN total fue preparado, reversa transcribe y amplificado mediante el método de 5′-carrera. Con un primer avance universal e iniciadores antisentidos para los dominios constantes de anticuerpos específicos de la clase, anticuerpo mRNAs fueron amplificados uniformemente en proporciones que reflejan sus frecuencias en las poblaciones de anticuerpos. Los amplicones fueron ordenados por secuenciación de próxima generación (NGS), que rinde más de 105 secuencias de anticuerpo por ejemplo inmunológica. Se describen los protocolos para el análisis de la secuencia de anticuerpos incluyendo anotación J-gen-segmento de V (D), una vista de pájaro el repertorio de anticuerpos y nuestros métodos computacionales.

Introduction

El sistema de anticuerpos es uno de los fundamentos del sistema inmune adquirido. Es altamente potente contra los invasores patógenos debido a su gran diversidad, especificidad de reconocimiento de antígeno fina y la expansión clonal de las células B antígeno específicas. El repertorio de células B productoras de anticuerpos se estima que más de 1015 en un solo individuo1. Esta enorme diversidad se genera con la ayuda de recombinación de genes VDJ de la inmunoglobulina lugares geométricos genéticos2. Descripción de los repertorios de toda la célula B y sus dinámicas cambios en respuesta a la inmunización de antígeno por lo tanto es difícil, pero esencial para una comprensión completa de la respuesta de anticuerpos contra patógenos invasores.

Debido a su diversidad astronómico, repertorios de células B se han considerado como una caja negra; sin embargo, el advenimiento de la tecnología NGS ha permitido avances para una mejor comprensión de su complejidad3,4. Repertorios de anticuerpos todo han sido correctamente analizadas, en primer lugar en pez cebra5, luego ratones6y los seres humanos6,7. Aunque NGS se ha convertido en una poderosa herramienta en el estudio de la respuesta inmune adaptativa, se carecen de análisis básicos de las similitudes y diferencias en repertorios de anticuerpos entre animales individuales.

En ratones, se informó que los repertorios de IgM son casi idénticos entre los individuos, mientras que los de IgG1 e IgG2c son sustancialmente diferentes entre individuos8. Además de Perfil de uso gene V, la frecuencia observada de Perfil de VDJ en las células B periféricas ingenuo es muy similar entre individuos8. El análisis de las secuencias de aminoácidos de la región de VDJ también demostró la ocurrencia de las mismas secuencias junctional en ratones diferentes mucho más con frecuencia que previamente pensamiento8. Estos resultados indican que los mecanismos para la formación del repertorio de anticuerpos pueden ser determinista y no estocásticos5,8,9. El proceso de desarrollo del repertorio de anticuerpos en ratones también correctamente analizado usando NGS para resaltar aún más el potencial de NGS para descubrir el sistema de inmune anticuerpo en detalle10.

En este informe, describimos un método simple y eficaz para visualizar y analizar un repertorio de anticuerpos a nivel mundial.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas y con la aprobación del Comité de uso y nacional Instituto de infecciosas enfermedades animales atención. Se obtuvo muestra de PBMCs de voluntarios adultos sanos, como el resultado representativo en este informe, se realizó con la aprobación del Comité de ética del Instituto Nacional de enfermedades infecciosas, Tokio, Japón y el consentimiento informado por escrito de cada participante utilizando un formulario aprobado por el Comité de ética. 1. primer diseño Diseñar un primer avance universal a cDNA para amplificar la inmunoglobulina mRNA sin sesgo de cartillas de la polimerización en cadena, como se usa en el 5′-carrera11,12 y SMART-PCR13 técnicas. Para la amplificación del gen de inmunoglobulinas VH, diseñar las secuencias de inmunoglobulina clase-específica en la región constante como cartillas inversa8,14 (figura 1A).Nota: Secuencias de Multiplex etiqueta pueden agregarse a cualquiera de estas cartillas a las moléculas de la biblioteca de fuentes diferentes de la muestra de la etiqueta. Secuencias para la polimerización en cadena jerarquizada también se pueden añadir, según el manual del kit utilizado15. Primer avance universal 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ Invertir cartillas para las inmunoglobulinas de ratón (Ref.8) IgM_CH1: 5′-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 ‘ IgG1_CH1: 5’-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 ‘ IgG2c_CH1: 5’-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 ‘ IgG3_CH1: 5′-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3′ IgA_CH1: 5′-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3′ Igκ_CH1: 5’-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 ‘ Igλ_CH1: 5’-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 ‘ Invertir cartillas para las inmunoglobulinas humanas (Ref.14) IgM_CH1: 5’-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 ‘ IgG_CH1: 5’-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 ‘ IgD_CH1: 5’-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 ‘ IgA_CH1: 5’-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 ‘ IgE1_CH1: 5’-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 ‘ IgE2_CH1: 5’-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 ‘ Igκ_CH1: 5’-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 ‘ Igλ_CH1: 5’-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 ‘ Tabla 1: Secuencias de Primer para la amplificación por PCR de las inmunoglobulinas 2. ácido nucleico aislada de células inmunes y los tejidos Nota: El procedimiento siguiente es para la extracción de ácidos nucleicos del bazo de ratón. Sin embargo, es aplicable a otros tejidos inmunes y células humanas como los ganglios linfáticos o las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (figura 1B). Disecar el tejido, por ejemplo, bazo de un ratón C57BL/6 de 8 semanas de edad y pasar a través de una malla de acero inoxidable (200 a 400 μm) con 2 mL de buffer PBS obtener células dispersas. Transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL y centrifugar durante 5 minutos a 600 × g y 4 ° c. Deseche el sobrenadante. Añadir 800 μl de tampón de lisis de ACK (150 m m de NH4Cl, 1 mM KHCO30,1 mM de Na2EDTA, pH 7.2) para el sedimento e incubar en hielo por 2 min a lyse células de sangre rojas en el tejido. Lavar las células del tejido con 2 mL de PBS 3 x, seguido por centrifugación durante 5 minutos a 600 × g y 4 ° c. Añadir 800 μl de reactivo de fenol/guanidina isotiocianato para la pelotilla, vortex e incubar a 25 ° c durante 5 minutos. Añadir cloroformo (200 μL), agitar manualmente durante 15 s y luego incubar 2 minutos a 25 ° c. Separar las fases por centrifugación durante 15 min a 12.000 x g y 25 ° c y transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añadir un volumen de etanol al 70%, vortex brevemente y aplicarlo a la columna de sílice de la vuelta. Eluir el RNA con 30 – 100 μl de agua. Cuantificar la concentración inicial de RNA utilizando un Fluorímetro (Tabla de materiales). Almacenar el RNA purificado a-80 ° c. 3. cDNA síntesis y amplificación de la polimerización en cadena Nota: El método descrito a continuación se basa en la raza 5’11,12 y SMART-PCR técnicas13. La información y la optimización de la reacción se describen en el manual del kit 15. Las materias primas para inmunoglobulina de ratón son la muestra del paso 2.10. Las materias primas para inmunoglobulina humana son la muestra de tejidos humanos, por ejemplo: PBMC, tratada como se describe en los pasos 2,3 a 2.10. Sintetizar el cDNA de la primera línea de 2 a 10 μg de plantilla de RNA total mediante cartilla CDS de 5’-carrera (oligo-despegue-que contienen) y oligonucleótido SMART-PCR (Tabla de materiales) según las instrucciones15 el fabricante. Para la inmunoglobulina de ratón, amplificación PCR de cDNA con alta fidelidad ADN polimerasa utilizando los primer avance universal y cartillas inversa de específicos de la clase de inmunoglobulina (tabla 1). Establecer las condiciones térmicas del ciclismo como: 94 ° c por 2 min y luego de 40 ciclos de 94 ° c por 30 s, 59 ° c por 30 s y 72 ° c por 30 s, seguido por un paso de extensión final a 72 ° c durante 5 minutos.Nota: Los experimentos típicos amplifican clases de inmunoglobulina IgM, IgG1, IgG2c, Igk e Igl para mirar la ingenua, dependientes de Th1 y linfocitos Th2 dependiente (figura 3). Para la inmunoglobulina humana, llevar a cabo la 1st polimerización en cadena usando el primer avance universal y cartillas inversa de específicos de la clase de inmunoglobulina (tabla 1) con secuencias de etiqueta. Incluyen las secuencias de índice para cada muestra por 2nd PCR utilizando cebadores de secuencia de índice. Uso de las siguientes condiciones de la PCR y la polimerasa de Taq: 94 ° c por 2 min, 21 ciclos (1st PCR) o (2nd PCR) de 32 ciclos a 94 ° c por 30 s, 59 ° c por 30 s, 72 ° c por 30 s.Nota: Los experimentos típicos amplifican IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (IgA1 y IgA2), las clases de la inmunoglobulina IgE, Igk e Igl para buscar en todas las poblaciones de la célula de B (figura 4). Electrophorese los productos PCR en un gel de agarosa y purificar fragmentos de bp de 600 a 800 usando una membrana de silicona spin-columna. Electrophorese la muestra de 3.2.1 o 3.2.2 en gel de agarosa al 2%. Visualizar las bandas de DNA en el transiluminador UV y suprimir la rebanada de gel que contiene la banda ancha entre 600 a 800 bp. Añadir 10 mL de solución de unión de membrana por 10 mg de gel de slice. Mezclar e incubar a 50 – 65 ° C hasta que se disuelva completamente el trozo de gel. Transvasar la solución de gel de sílice membrana spin-columna. Una vez lavado con tampón de lavado y eluir el ADN con 50 mL de agua libre de nucleasas (Tabla de materiales). Cuantificar los amplicones purificados con un fluorómetro y piscina amplicones de cada clase de inmunoglobulina en cantidades iguales para la secuencia de NGS.Nota: Típicamente, 2-10 mg productos ADN fue recuperado para cada clase de inmunoglobulina. Mezclar cada solución de prueba igualmente en la cantidad de ADN para dar aumento 50 mL de solución contiene 10-20 ng/mL ADN. Determinar el tamaño y concentración de bibliotecas mediante una electroforesis en capilar en base con el chip del tamaño de ADN (Tabla de materiales). Almacenar las bibliotecas a – 20 ° C. 4. NGS secuenciación de bibliotecas Generar un SampleSheet.cvs para el secuencia ejecución especificando nombre de la muestra, información del índice de e instruir para obtener archivos de .fastq. Descongelar el cartucho de reactivos (Tabla de materiales) y las bibliotecas. Hacer 0.2 N NaOH y diluir las bibliotecas para obtener la concentración molar. Enjuague y seque la célula de flujo. Agregar 600 mL de solución diluida y desnaturalizada de la biblioteca en el pozo del cartucho de reactivo. Iniciar el funcionamiento de la secuencia. 5. Control de calidad de datos NGS Realizar el control de calidad de datos FASTQ usando el “FASTX-Toolkit”16.Nota: Un ejemplo básico de la configuración de los parámetros utilizados es el siguiente:fastq_quality_trimmer – v -t 20 – l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastq_quality_filter – v – q 20 – p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastx_reverse_complement – v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] Formato de los archivos de salida a “ácido nucleico de fasta (.fna)” mediante el siguiente comando:fastq_to_fasta – v – n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna] 6. extracción y análisis de secuencias de inmunoglobulina de .fna datos Nota: Los programas de ejemplo fueron puestos en ejecución en un entorno UNIX. Por favor usarlos como un ejemplo referencias porque el rendimiento puede depender del entorno de hardware y sistema operativo. Los autores no aceptan ninguna responsabilidad por errores u omisiones. Lenguajes de programación, Perl17, R18los módulos necesarios que deba ser instalado según las instrucciones en las páginas web citadas. el programa IgBLAST que deba ser instalado según las instrucciones en el sitio web apropiado19,20. Descargar los siguientes ejemplos de programas in-House para el análisis del repertorio de https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:03_PipeLine_Mouse.zip; Un conjunto de programas de ejemplo para el análisis de secuencias del anticuerpo de ratón.05_PipeLine_Human.zip; Un conjunto de programas de ejemplo para el análisis de secuencias de anticuerpo humano. Extracto del anticuerpo Lee los datos de la secuencia: las secuencias de inmunoglobulina (Ig) de cada clase de Ig del extracto de los datos (.fna) por un programa en Perl que busca en las secuencias de la firma en cada región constante de la inmunoglobulina (tabla 2). Para los genes de cadenas pesadas (IgH) inmunoglobulina de ratón, extracto de la muestra mediante el siguiente comando:$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [entrada nombre de archivo] [archivo de salida (sufijo)] Para la cadena ligera de inmunoglobulina de ratón genes (IgL) extracción de la lectura mediante el siguiente comando:$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [entrada nombre de archivo] [archivo de salida (sufijo)] Para los genes de cadenas pesadas (IgH) de inmunoglobulina humana, extracto de la muestra mediante el siguiente comando:$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [entrada nombre de archivo] [archivo de salida (sufijo)] Para los genes de la cadena ligera (IgL) de inmunoglobulina humana, extracto de la lectura mediante el siguiente comando:$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [entrada nombre de archivo] [archivo de salida (sufijo)] Anotar y controlar la productividad de la recombinación de V (D) J gen:Nota: El método descrito a continuación utiliza independiente IgBLAST19 para la anotación de segmentos génicos de V (D) J en la secuencia. Establecer la base de datos de los genes V (D) J y los ajustes de parámetro para IgBLAST como descrito20. Anotar los genes de cadenas pesadas (IgH) de inmunoglobulina de ratón mediante el siguiente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organismo del ratón – domain_system imgt-consulta. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Anotar los genes de cadena ligera (IgL) de la inmunoglobulina de ratón mediante el siguiente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organismo del ratón – domain_system imgt-consulta. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Anotar los genes de cadenas pesadas (IgH) inmunoglobulina humana mediante el siguiente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organismo humano – domain_system imgt-consulta. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Anotar los genes de la cadena ligera (IgL) de inmunoglobulina humana mediante el siguiente comando:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organismo humano – domain_system imgt-consulta. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.AUX-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Visualizar la función global de un repertorio de anticuerpos. Visualizar el repertorio de IgH de ratón mediante el siguiente comando:$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.shNota: El archivo de entrada es filename.fna (datos de la secuencia), preferiblemente el archivo de salida de 6.2.1. Este archivo debe ser colocado en un directorio inferior (carpeta) llamado “nombre de archivo”. En la línea 50 de la secuencia de comandos de shell, asignar un “nombre de archivo” Para_4. Visualizar el repertorio humano de IgH mediante el siguiente comando:$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.shNota: El archivo de entrada es filename.fna datos de la secuencia, preferiblemente el archivo de salida de 6.2.3. Este archivo debe colocarse en el directorio inferior (carpeta) que nombre es “nombre de archivo”. En la línea 46 del script de shell, asignar un “nombre de archivo” Para_4. Visualizar el repertorio de la IgL de ratón mediante el siguiente comando:$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.shNota: Con este gasoducto, Igk y Igl se procesan concomitante. El archivo de entrada es filename.fna (datos de la secuencia), preferiblemente el archivo de salida de 6.2.2. Este archivo debe colocarse en el directorio inferior (carpeta) llamado “nombrearchivo”. En la línea 53 de la secuencia de comandos de shell, asignar un “nombre de archivo” Para_4. Nombre de archivo de salida, terminando con “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” da las coordenadas de un gráfico de barras de dos dimensiones (figura 3, IgL). Visualizar el repertorio humano de IgL mediante el siguiente comando:$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.shNota: Con este gasoducto, Igk y Igl se procesan concomitante. El archivo de entrada es filename.fna datos de la secuencia, preferiblemente el archivo de salida de 6.2.4. Este archivo debe ser colocado en un directorio inferior (carpeta) llamado “nombre de archivo”. En la línea 53 de la secuencia de comandos de shell, asignar “nombredearchivo” para Para_4. El nombre de archivo de salida termina con “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” da las coordenadas de un gráfico de barras de dos dimensiones (figura 4, IgL).

Representative Results

Repertorios de anticuerpos de ratón Puede obtenerse una perspectiva de un repertorio de anticuerpo murino en un conjunto de células o tejidos como el bazo, médula ósea, ganglios linfáticos o sangre. La figura 3 muestra resultados representativos de IgM, IgG1, IgG2c e inmunoglobulina repertorios de cadena ligera (IgL) de un bazo de ratón de ingenuo. En tabla 3se muestra el Resumen de los números leídos. Por ejemplo, 166.175/475.144 Lee contenidos secuencia de firma de IgM específicos (tabla 2) y Lee 133.371/166.175 VDJ-productivo deducido por IgBLAST19. La figura 3 muestra un perfil de repertorio de reordenamiento VDJ por 3D-VDJ-parcela, en la que el tamaño de cada bolita representa el número relativo de Lee; en otras palabras, el número de los mRNAs del anticuerpo en células B todo. La malla 3D consiste en 110 IGHV IGHD 12 y 4 IGHJ, que se alinean para reflejar su orden en el cromosoma. Además, los genes ambiguo asignados por IgBLAST se colectaron por separado en la última posición de cada línea IGHV, IGHD y IGHJ, dando lugar a 7.215 nodos en el cuboide. Además, se muestra en la figura 3 es un 2D-VJ-diagrama mostrando el perfil de VJ-cambio en el repertorio de la IgL. La longitud de cada barra en esta parcela representa el número relativo de Lee. El eje x representa IGLVκ 101 y 3 genes IGLVλ, y el eje y representa 4 IGLJκ y 3 IGLJλ genes. Los unannotated V-J-genes y están representados en el límite derecho. La región determinante de complementariedad 3 (CDR3) se dan secuencias de estas lecturas productivas, que dan lugar a la mayoría de la especificidad de unión a antígeno, en salidas de IgBLAST. La CDR3 secuencias pueden analizarse estadísticamente, incluyendo réplicas biológicas o técnicas, como se ha descrito anteriormente8,10. Repertorios de anticuerpos humanos Una perspectiva de un repertorio de anticuerpos humanos en su conjunto puede ser analizada desde diversos tejidos incluyendo las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o tejidos patológicos. La figura 4 muestra los resultados representativos de IgM, total de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), total de IgA (IgA1 y IgA2), IgD, IgE y IgL repertorios de PBMCs normales. En tabla 3se muestra un resumen de los números leídos. Por ejemplo, 90.238/1.582.754 Lee contenidos secuencia de firma de IgM específica y Lee 67.896/90.238 VDJ-productivo. Se muestra el perfil de repertorio de reordenamiento VDJ en 3D-VDJ-parcela en la que el tamaño de cada bolita representa el número relativo de Lee; en otras palabras, el número de anticuerpos mRNAs de PBMCs enteros (figura 4). La malla 3D consta de 56 IGHV, IGHD 27 y 6 IGHJ, alineados en el orden en que aparecen en el cromosoma. Además, ambiguo asignados por IgBLAST los genes se representan por separado en la última posición de cada línea IGHV, IGHD y IGHJ, dando lugar a 11.172 nodos en el cuboide. El perfil de VJ-cambio en el repertorio de IgL es representado en 2D-VJ-parcela en la que la longitud de cada barra representa el número relativo de Lee (figura 4). El eje x representa 32 genes IGLVλ y IGLVκ 41, y el eje y representa 5 IGLJκ y 5 IGLJλ genes. El o.n.u-V – y J-genes anotados están representados en el límite derecho. En IgBLAST se dan las secuencias CDR3 humanas salidas y se pueden analizar estadísticamente como se describió anteriormente8,10. Clase de inmunoglobulina Sentido Antisentido Cadenas pesadas de inmunoglobulina de ratón (C57BL/6) IgM AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC GACATTTGGGAAGGACTGACT IgG1 AAAACGACACCCCCATCTGTC GACAGATGGGGGTGTCGTTTT (Variante de IgG1) AAAACAACACCCCCATCAGTC GACTGATGGGGGTGTTGTTTT IgG2c AAAACAACAGCCCCATCGGTC GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgG3 GTGATCCCGTGATAATCGGCT AGCCGATTATCACGGGATCAC IgA TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG Cadenas ligeras de inmunoglobulina de ratón (C57BL/6) Igκ CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG Igλ1 TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ2 TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ3 TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA Igλ4 TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA Cadenas pesadas de inmunoglobulina humana IgM GGGAGTGCATCCGCCCCAAC GTTGGGGCGGATGCACTCCC De igG GCTTCCACCAAGGGCCCATC GATGGGCCCTTGGTGGAAGC IgA GCATCCCCGACCAGCCCCAA GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgD GCACCCACCAAGGCTCCGGA TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC IgE GCCTCCACACAGAGCCCATC GATGGGCTCTGTGTGGAGGC Cadenas ligeras de inmunoglobulina humana Igκ ACTGTGGCTGCACCATCTGC GCAGATGGTGCAGCCACAGT Igλ1, 2, 6 GTCACTCTGTTCCCGCCCTC GAGGGCGGGAACAGAGTGAC Igλ3, 7 GTCACTCTGTTCCCACCCTC GAGGGTGGGAACAGAGTGAC Tabla 2: Resumen de las secuencias de la firma de la inmunoglobulina Ratón IgH Total lecturas IgM IgG1 IgG2c Entrada 475.144 CIG-que contienen 166.175 229.671 36.628 VDJ-productivo 133.371 196.583 31.446 IgL de ratón Total lecturas IgKappa IgLambda Entrada 527.668 CIG-que contienen 178.948 21.446 VJ-productivo 160.924 16.988 IgH humana Total lecturas IgM De igG IgA IgD IgE Entrada 1.582.754 CIG-que contienen 90.238 5.298 94.061 75.549 2.932 VDJ-productivo 67.896 2.775 78.203 56.495 3 IgL humana Total lecturas IgKappa IgLambda Entrada 1.582.754 CIG-que contienen 120.316 64.148 VJ-productivo 97.169 52.324 Tabla 3: Resumen de los números leídos en los experimentos Figura 1: representación esquemática de la estrategia de secuenciación para analizar repertorios de anticuerpos en ratones individuales. (A) ARN total de las células inmunes o tejidos era transcripción inversa y PCR amplificados con el primer avance universal y específico de la clase inmunoglobulina atrás cartillas. Los amplicones de cada clase de inmunoglobulina se agruparon y prestados para secuenciación de próxima generación. (B) el biológico Replica como bazos de ratones C57BL/6 fueron tratados como sigue: total RNAs fueron purificados de muestras de bazo y cDNAs fueron amplificados por la 5′-carrera con la imprimación universal y primer clase-específica de anticuerpos. Luego fueron despojados para la secuenciación de próxima generación con etiquetado cartillas para los ratones. Partes de la figura están adaptadas de8 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: esquema de diagrama de flujo del procesamiento de datos para analizar los repertorios de anticuerpos en ratones individuales. Lecturas de amplicones obtenidos después de la secuenciación de próxima generación se procesaban como sigue: (1) leer secuencias fueron comprobados por la presencia de anticuerpos específicos de la clase firma secuencias; (2) secuencias fueron examinadas para la V, D, y gene J fragmentos utilizando IMGT/HighV-Quest o IgBLAST; (3) las secuencias que contienen a un cruce productivo de VDJ fueron recogidas; y (4) estas secuencias fueron utilizadas para el análisis de características de repertorio general, CDR3, etc. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: visualización de datos globales para repertorios de anticuerpos de ratón. Los perfiles generales del repertorio de cada clase de anticuerpo fueron visualizados por 3D-VDJ-parcela. El eje x representa 110 genes IGHV ordenados que en el cromosoma. La y – y z – axis representa IGHD 12 y 4 genes IGHJ, respectivamente. El volumen de esferas en cada nodo representa el número de lecturas. Esferas rojas: genes V, D y J no anotados. El IgL Lee distribuciones se muestran en 2D-VJ-parcela en la que la longitud de cada barra representa el número relativo de Lee. El eje x representa 101 x 3 genes de x IGLVλ y IGLVκ, y el eje y representa 4 x 3 genes de x IGLJλ y IGLJκ. En la frontera derecha están representados los genes V y J sin anotada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: visualización de datos globales para repertorios de anticuerpos humanos. Los perfiles generales del repertorio de cada clase de anticuerpo fueron visualizados por 3D-VDJ-parcela. El eje x representa 56 genes IGHV ordenados que en el cromosoma. La y – y z – axis representa IGHD 27 y 6 genes IGHJ, respectivamente. El volumen de esferas en cada nodo representa el número de lecturas. Esferas rojas: genes V, D y J no anotados. El IgL Lee es dispuesto en 2D-VJ-parcela en la que la longitud de cada barra representa el número relativo de la Lee. El eje x representa 41 x 32 genes de x IGLVλ y IGLVκ, y el eje y representa el 5 x 5 genes de x IGLJλ y IGLJκ. El o.n.u-V – y J-genes anotados están representados en el límite derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El método descrito aquí utiliza NGS para anticuerpos ARN amplificado mediante el método de 5′ de carrera. En contraste con los métodos que utilizan iniciadores de genes degenerados 5′-VH , mRNAs de cada clase de anticuerpo son amplificados con cebadores universales hacia adelantados. Además, el uso de iniciadores antisentidos específicos para la región constante 1 (CH1) del gene del anticuerpo permite perfiles de repertorio de clases de la inmunoglobulina específica. Esto es muy beneficioso para la respuesta de anticuerpos específicos de la clase de disección, así como para comparar ingenuo y repertorios vacunados8,9.

Una trampa más probable del método es la escasez de mensajes de inmunoglobulina amplificado. Depende de la profundidad del repertorio de anticuerpos obtenido por el presente Protocolo substancialmente en la amplificación de PCR descrita en los pasos 3.1 y 3.2. Si no se obtiene correctamente la profundidad del repertorio, cambiando las proporciones de cDNA de la plantilla y las cartillas en pasos 3.2.1 o 3.2.2 es muy recomendable.

En general, aproximadamente el 20% de las lecturas de anticuerpo producidos por NGS son secuencias ambiguas21. “Métodos de corrección”, establecido con 5-10% siguen siendo ambiguos3. Por lo tanto, analizamos la secuencia y había filtrado Lee crudo que contienen secuencias de firma correspondiente a regiones constantes de inmunoglobulina (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etcetera). Por lo tanto, el análisis de hyper mutaciones somáticas necesita exámenes cuidadosos.

Una de las limitaciones de este método es inmunoglobulina pesada y cadena ligera de la pareja es incapaz de ser inferido. Por lo tanto el punto de vista de repertorio obtenido por este método no es holístico. Sin embargo, es posible aproximar los pares de alto rango por análisis estadístico de los datos10. También, un método novedoso para la secuencia de los pares de la inmunoglobulina fue divulgado recientemente3,4.

Se obtuvieron las secuencias de inmunoglobulina en los datos de salida .fna basado en la presencia de secuencias firma del gene de la inmunoglobulina. Evaluaron el gen V, D y J segmentos entonces fueron anotados y la productividad de los cambios de V (D) J. La región determinante de complementariedad 3 (CDR3) secuencias fueron también anotadas. Estos exámenes sistemáticos de secuencias de inmunoglobulina en datos .fna provechosamente fueron proporcionados por el servidor IMGT/HighV-QUEST22,23,24. Sin embargo, construir un oleoducto de tratamiento automatizado tiene el mérito de analizar los datos experimentales grandes. La tubería para requisitos particulares para cada propósito es posible establecer mediante el uso de la independiente del Protocolo de IgBLAST19. Este enfoque necesita conocimientos básicos de programación pero es muy útil para los análisis detallados del sistema de la inmunoglobulina. Las tuberías descritas son los ejemplos del protocolo modificado para requisitos particulares (figura 2).

El número de anticuerpos Lee es proporcional a la cantidad de anticuerpo RNAs en la muestra, que refleja a los componentes de anticuerpos del sistema anticuerpo en dado momento puntos5,8,25. El método aquí descrito da una vista panorámica de la Constitución de la V (D) J de un repertorio de anticuerpos usando R programas8,18,26.

La visión global de los repertorios de anticuerpos IgM de ratones individuales ingenuo revelaron un perfil altamente conservado de VDJ en comparación con los de IgG1 o IgG2c8. Se informó que combinaciones VDJ de pez cebra inmaduro son altamente estereotipados9. Por el contrario, combinaciones VDJ humanos se divulgan para ser altamente sesgada6. El VDJ-perfiles deterministicos altamente conservados en ingenuo B células son probablemente generada ya sea por cambios de VDJ sesgados o negativa selección con auto-antígenos presentados en el cuerpo. Por ejemplo, IGHV11-2 se expresa preferencialmente en la IgM fetal repertorio27 y este predominio se atribuye a la autoreactivity de IGHV11-2 contra eritrocitos senescentes27. Curiosamente, IGHV11-2 era también el repertorio principales más comun en nuestro análisis previamente publicados de ingenuo IgM8.

El método descrito aquí es útil para descifrar repertorios de anticuerpos antígeno respuesta analizando inclusive el espacio del repertorio de anticuerpos generado en cuerpos individuales, evitando la omisión involuntaria de repertorios de anticuerpos clave8, 10. Este método también permite la examinación del dinamismo de red detallada del anticuerpo, que facilitaría aceleró el descubrimiento de anticuerpos protectores contra emergentes patógenos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una subvención de AMED bajo la concesión número JP18fk0108011 (KO y SI) y JP18fm0208002 (TS, KO y YO) y una subvenciones desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (15K 15159) a KO. Agradecemos a Sayuri Yamaguchi y Satoko Sasaki por la valiosa asistencia técnica. Nos gustaría agradecer Editage (www.editage.jp) para la edición de lengua inglesa.

Materials

0.2 mL Strip Tubes Thermo Fisher Scientific AB0452 120 strips
100 bp DNA Ladder TOYOBO DNA-035 0.5 mL
2100 Bioanalyzer Systems Agilent Technologies G2939BA /2100
Acetic Acid Wako 017-00256 500 mL
Agarose, NuSieve GTG Lonza 50084
Ammonium Chloride Wako 017-02995 500 g
Chloroform Wako 038-02606 500 mL
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” NISSUI  08192
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) Wako 345-01865 500 g
Falcon 40 µm Cell Strainer Falcon 352340 50/Case
ling lock tube 1.7 mL BM EQUIPMENT BM-15
ling lock tube 2.0 mL BM EQUIPMENT BM-20
MiSeq Reagent Kit v2 illumina MS-102-2003 500 cycles
MiSeq System illumina SY-410-1003
NanoDrop 2000c Spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
Potassium Hydrogen Carbonate Wako 166-03275 500 g
PureLink RNA Mini Kit life technologies 12183018A
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 500 assays
SMARTer RACE 5’/3’ Kit  Clontech  634858
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version  Takara Bio Inc.  RR006A 
Trizma base Sigma T6066 1 kg
TRIzol Reagent AmbionThermo Fisher Scientific 15596026 100 mL
Ultra Clear qPCR Caps Thermo Fisher Scientific AB0866 120 strips
UltraPure Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega  A9282
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References

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Sun, L., Kono, N., Toh, H., Xue, H., Sano, K., Suzuki, T., Ainai, A., Orba, Y., Yamagishi, J., Hasegawa, H., Takahashi, Y., Itamura, S., Ohnishi, K. Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (145), e58804, doi:10.3791/58804 (2019).
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