CRISPR を介したゲノム人間病原菌カンジダの編集

1. 身分証明書とガイド RNA シーケンスのクローニング ガイド RNA 配列の同定 識別、5′-NGG-3′ PAM シーケンス停止コドンが挿入される場所の近くにあります。(図 1 a)というラベルの付いたすべての PAM のシーケンスはTPK2 (図 1 a) の最初 100 塩基対で発見ことがされます。注:Http://osf.io/ARDTX 11,12ガイド系列各c.albicans開いたリーディング ・ フレームをターゲットを見つけることが。 20 となる前方ガイド Primer_3 シーケンスを特定拠点直接上流 NGG PAM のサイト、5 以上を含まない行で Ts。左クリックで直接ベースの上流 NGG のドラッグ カーソル 20 拠点、プライマーを追加するプライマー] タブでをクリックします。 前方ガイド シーケンスを補完するものとなるガイド Primer_3 の逆シーケンスを識別します。注:PAM_3 を使用してガイドを示します (図 1 b)。 プライマーを右クリックし、「プライマー データをコピー」を選択します。シーケンスをテキスト編集プログラムに貼り付けます。 (表 1、図 1 b) をクローン作成を容易にする前方および逆引きガイド oligos にオーバー ハングのシーケンスを追加します。 購入する前に前方ガイド Primer_3 の 5′ 末端に塩基配列 ATTTG を追加します。 購入する前に前方ガイド Primer_3 の 3′ 末端に G を追加します。 購入する前にガイドの逆 Primer_3 の 5′ 末端に塩基 AAAAC を追加します。 購入する前に、ガイドの逆 Primer_3 の 3′ 末端に C を追加します。 ダイジェスト CaCas9 式ベクトル pV1524 BsmBI と。注: pV1524 には、アンピシリン (アンプr) と nourseothricin (Natr) マーカーが含まれています。Cas9 は、 C. albicansのコドン最適化されています。 追加することによってプラスミッドをダイジェスト: 2 μ g pv1524、バッファー x 10 の 5 μ L、BsmBI、および H の 1 μ L の2O 1.5 mL チューブに 50 μ L に。55 ° C、20 分で孵化させなさい (または、消化 Esp3I、37 ° C での BsmBI、isoschizomer と 15 分のための pv1524) 部屋の温度 (RT) と 30 のスピンにクール チューブの底に凝縮させる 2,348 x gで s。1.4 をステップに進むまたは-20 ° C で消化されたプラスミドを格納 消化のバックボーンのアルカリホスファターゼ-御馳走。 消化の混合物にふくらはぎ腸のアルカリホスファターゼ (CIP) の 1 μ L を追加し、37 ° C 1 時間インキュベートします。 市販のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 精製キット (キットの指示) を使用して消化されたプラスミドを浄化し、30 μ L の溶出バッファー (EB) で溶出します。 リン酸化し、アニール ガイド Primer_3 フォワードとリバース ガイド Primer_3。 100 μ M 前方の 0.5 μ L ガイド Primer_3、100 μ M の 0.5 μ L を追加 43 μ H2O PCR チューブに T4 ポリヌクレオチド キナーゼの 1 μ L、5 μ L の 10 x T4 リガーゼ バッファー ガイド Primer_3 の逆。 第 2 PCR チューブに 10 x T4 リガーゼ バッファーの 5 μ L、T4 ポリヌクレオチド キナーゼの 1 μ L と分子生物学グレード H2O の 44 μ L を追加します。注:これは負の制御として役立ちます。 当時 95 ° C、5 分、30 分の 37 ° C でたちの反応混合物を孵化させなさい。 アニール 16 ° c 低速ランプに入る率で混合物を冷却、oligos。4 ° C で熱処理したオリゴ混合物を配置します。 1.4.3 のステップから消化 pv1524 に焼なまし oligos を縛る。 PCR チューブに以下を追加します: 10 x T4 リガーゼ バッファー、T4 DNA リガーゼの 0.5 μ L、焼なましオリゴ ミックス 0.5 μ の 1 μ L 消化 CIP 処理精製プラスミド (20-40 ng) と H2O 10 μ L の総ボリュームに。 PCR チューブに以下を追加します: 10 x T4 リガーゼ バッファー、T4 DNA リガーゼの 0.5 μ L の 1 μ L 消化 CIP 処理精製ベクトル (20-40 ng)、陰性対照の混合物、および H2O 10 μ L の総ボリュームまでの 1 μ L。 16 ° C、30 分で、10 分の 65 ° C でたちで両方のチューブをインキュベートし、25 ° C に冷却 結紮混合物の 5 μ L を化学的に有能な腸管出血性大腸菌DH5α 標準的な熱衝撃変形のプロトコルを使用してに変換します。LB アンプ/Nat メディア (200 μ g/mL アンプ、50 μ g/mL Nat) を選択します。注:PV1524 とその誘導体二重選択メディアを選ぶ失敗は細菌で FLP/FRT 切除によって Nat/CaCas9/ガイド モジュールの損失になります。 Miniprep、によって 4 つの形質転換体からプラスミドを浄化、配列のプライマー (表 1) で挿入の一連のシーケンスです。注: 4 形質転換体をシーケンス処理時間のほとんどは少なくとも 1 正しいクローンを識別するために十分です。 -20 ° C にてサイトをカット BsmBI に単一の時間をクローン作成ガイド RNA シーケンスを持つプラスミドを保存します。 2. 設計と修理テンプレートの生成 遺伝子の塩基配列で左クリックしてエンコード停止コドンと制限消化サイト (図 1、表 1) ヌクレオチドを追加停止コドンを挿入します。注:挿入は、PAM のシーケンスが中断されます。注:制限消化サイトはクローン (図 1) の効率的なスクリーニングを容易にする修理テンプレート順番に表示されます。 10 の突然変異の箇所の拠点を下流とドラッグ カーソル 60 塩基上流を左クリックします。プライマーを追加するプライマー] タブをクリックします。これは修理テンプレート Forward_3 を追加します。10 塩基上流の突然変異が行われるとドラッグ カーソル 60 拠点下流を左クリックします。プライマーを追加するプライマー] タブをクリックします。これは修理テンプレートを逆に 3 を追加します。(図 1) 修理のテンプレートを生成するプライマー拡張を実行します。 Deoxynucleotide 三リン酸塩 (dNTPs) の 6 μ L、100 μ m 修理テンプレート逆プライマーの 1.2 μ L 100 μ m 修理テンプレートの前方プライマー 1.2 μ L を追加 (濃度を合計 40 mM)、6 のバッファー、Taq ポリメラーゼ (3 台)、0.6 μ L および H2O 4 PCR のそれぞれに 45 μ μ L チューブ。 PCR の 20 と 30 でラウンド間実行してプライマー拡張を実行します。延長条件の例: 95 ° C で 2 分 (30 95 ° C、50 ° c、68 ° C で 1 分 1 分で s) x 34、68 ° C で 10 分 すべて 4 PCR チューブ 1.5 mL チューブの内容を組み合わせて、50 μ L H2o. の製品を浄化するために PCR 精製キットを使用して 260 で吸光度を決定することにより十分な DNA を確保するためプライマー拡張製品を量的に表わす nm。注:プライマー拡張製品の典型的な最終濃度は ~ 200-300 ng/μ L。 3. C. albicans修理テンプレートとプラスミドの変換 テ/リチウム アセテートを作る。 ミックス 10 mM Tris Cl 1 mM EDTA 100 mM リチウム アセテート、H2O (すべて原液 pH 7.5) 50 mL 容量を達成するために。 プレートを作る ミックス 40% PEG 3350、酢酸リチウム 100 mM、10 mM Tris Cl、1 mM EDTA、H2O (すべて原液 pH 7.5) 50 mL 容量を達成するために。 ステップ 1.9 から正しく複製プラスミドを消化します。 0.5 μ KpnI、SacI、0.5 μ H20 に 40 μ L の容量 1.5 mL チューブ、10 μ g のプラスミド、10 x バッファーの 4 μ L、10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) 0.4 μ L を追加します。37 ° C 一晩 (図 1) で孵化させなさい。 C. albicans SC5314、野生型 prototroph、25 ° c 外径600 6 未満に理想的に 0.27 mM ウリジン (YPD + Uri) を添加した酵母ペプトン ブドウ糖での夜行文化を育てます。 2,348 x gで 5 分間回して 5 外径600単位変換ごとにセルをペレットし、100 μ L TE/リチウム アセテートの小球形にされたセルの 5 外径600を中断します。 次の順序で 1.5 mL チューブに追加: ステップ 3.4.1、ゆで卵、迅速な冷却サケ精子 DNA (10 mg/mL) 3) 10 μ g のプラスミド消化手順 3.3.1, 精製修理テンプレートの 4) 6 μ g からの 2) 40 μ L からの細胞の 1) 100 μ L、5) プレートの 1 mL。 次の順序で 1.5 mL チューブに追加: セルの 1) 100 μ L、ゆで卵、迅速な冷却サケ精子 DNA (10 mg/mL)、3) H2O ボリューム ステップ 3.5、およびプレートの 4) 1 mL の DNA の変換と同等の 2) 40 μ L。注: これはネガティブ コントロールとなります。 軽くピペッティングによる変換をミックス、25 ° C で一晩インキュベートします。 熱 25 分 44 ° C の水浴でそれらを配置することによって、細胞に衝撃を与えます。 ベンチトップ遠心分離機で 2,348 x gで 5 分間スピンし、プレートの混合物の上澄みを削除します。2,348 x gで YPD + Uri と再び 5 分間遠心の 1 mL を追加することで一度洗います。 YPD + Uri の 0.1 mL のセルを中断し、ローラー ドラムまたは 25 ° C でシェーカーで一晩インキュベートします。 200 μ g/mL nourseothricin YPD + Uri のプレート。植民地は、2-5 日に表示されます。 4. 単一コロニーのための縞 四分の一に、100 mm × 15 mm のペトリ皿を分割し、各作業領域にラベルを付けます。 四半円点の最長の辺の間で生殖不能のつまようじまたはアプリケータ連勝と変換プレートからコロニーの 1 つをタップします。 無菌技術を使用して単一コロニーの連勝し、2 日間の 30 ° C で成長するコロニーを許可します。 5. コロニー PCR 前方チェック プライマー (FCP) ~ 200 塩基対上流導入された制限サイトのと逆チェック プライマー (RCP) ~ 300 塩基対下流設計します。 FCP、RCP、耐熱性ポリメラーゼ (ExTaq 1.5 単位) の 0.3 μ L、dNTPs の 3 μ L の 0.3 μ L の 0.3 μ L を追加 (濃度を合計 40 mM)、3 μ ExTaq バッファー、および 23 μ H2O 1.5 mL チューブに。注:0.5 μ L/反応ジメチルスルホキシド (DMSO) の付加は PCR の効率を向上できます。 4.1.2 の手順から単一酵母コロニーの 0.25 μ L を 5.1.1、P10 のピペット チップを使用し、寒天を邪魔しないように世話のステップからの混合物に追加します。 PCR によって DNA を増幅して増幅が成功すると、管の底で細胞ペレットを邪魔しないように世話を確認するゲルの PCR の 5 μ L を実行します。 6. コロニー PCR の制限の消化力 PCR 製品 (管の底で細胞ペレットを邪魔しないように注意)、バッファーの 3 μ L、制限酵素の 1 μ L、H2O の 16 μ L の 10 μ L を追加し、製造元の指示に従ってを孵化し、対応を識別するために agarose のゲルの解決ct ゲノム編集。注:ここで使用される制限の酵素、 TPK2特定の修復テンプレートでエンコードされたサイトです。 7. 菌株の保存 30 ° C で YPD + Uri の制限の消化力によって確認されている植民地から一晩文化を育てる -80 ° C で保存に適した管に 1 mL (25% グリセロールの最終的な集中をもたらす) 50% のグリセロールの文化の 1 mL を追加します。 -80 ° C で正しいクローンを格納します。注:正しい系統は、長年にわたって-80 ° C で保存できます。 8. Natrマーカーの削除 酵母ペプトン マルトース (YPMaltose) に連勝正しい形質 (2% マルトース)。 すじ状のプレートからコロニーをピックアップし、液体 YPMaltose 20 g/L マルトースで 30 ° C で 48 h 用酵母を培養します。 YPMaltose 20 g/L マルトースに 200-400 細胞をプレートし、30 ° C 24 時間で孵化させなさい。 YPMaltose と YPMaltose 200 μ g/mL 国立にプレートを複製します。 30 ° C 24 時間で孵化させなさい。注:もはや YPMaltose 200 μ g/mL nourseothricin に成長するが、YPMaltose に成長した植民地は、Natrマーカー (CaCAS9)を失っているし、RNA をガイドします。 Natrマーカー (CaCAS9)とガイド RNA 手順 7.1-7.3 のように失っている系統を保存します。注:似たようなプラスミッド、pV1393、 MAL2のプロモーターではなくSAP2を使用します。YCB-BSA の成長は、pV1393 遺伝子の編集に使用する場合 flippase と Natrの除去を誘発します。