Mediada por CRISPR genoma edição do patógeno humano fungo Candida albicans

1. identificação e clonagem de sequência guia RNA Identificação da guia sequência de RNA Identificar uma 5′-NGG-3′ sequência de PAM perto onde será inserido o códon de parada. (Figura 1A) Rotulado todos PAM sequências encontram os primeiros 100 pares de base de TPK2 (figura 1A).Nota: Guia sequências alvo cada frame de leitura aberto de c. albicans podem ser encontradas em http://osf.io/ARDTX 11,12. Identificar a sequência de Primer_3 de guia para a frente, que será a 20 bases diretamente de um NGG PAM site EPorta não conterá mais de 5 Ts em uma fileira. Botão esquerdo do mouse sobre a base diretamente contra a corrente da NGG e arraste o cursor de 20 bases, em seguida, clique na guia para adicionar a primeira demão de primer. Identifica a sequência inversa guia Primer_3, que será o complemento para a sequência do guia para a frente.Nota: Mostrados são guias que usam PAM_3 (figura 1B). A primeira demão com o botão direito e selecione “copiar os dados da primeira demão”. Cole as sequências em um programa de edição de texto. Adicione sequências de saliência oligos para diante e reversa guia para facilitar a clonagem (tabela 1, figura 1B). Adicione a sequência de nucleotídeos ATTTG à extremidade 5′ do Primer_3 de guia para a frente antes de comprar. Adicione G à extremidade 3′ do Primer_3 de guia para a frente antes de comprar. Adicione a sequência de nucleotídeos AAAAC à extremidade 5′ da reverter guia Primer_3 antes de comprar. Adicione C à extremidade 3′ da reverter guia Primer_3 antes de comprar. CaCas9 Digest expressão vetorial pV1524 com BsmBI.Nota: pV1524 contém uma ampicilina (Ampr) e nourseothricin (Natr) marcadores. Cas9 tem sido códon otimizado para c. albicans. Digerir o plasmídeo, acrescentando: 2 μg de pv1524, 5 μL de tampão de 10x, 1 μL de BsmBI e de H2O para 50 μL em um tubo de 1,5 mL. Incubar a 55 ° C por 20 min. (Alternativamente, digerir pv1524 por 15 min com Esp3I, um isoschizomer de BsmBI, a 37 ° C.) Fixe a temperatura ambiente (RT) e rotação para 30 s a 2.348 x g para trazer a condensação no fundo do tubo. Prossiga para a etapa 1.4 ou armazenar o plasmídeo digerido a-20 ° C. A espinha dorsal digerida fosfatase-deleite. Adicionar 1 μL de fosfatase intestinal do bezerro (CIP) para a mistura de digestão e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Purificar o plasmídeo digerido usando um kit de purificação de reação em cadeia (PCR) comercialmente disponível do polymerase (as instruções fornecidas com o kit) e Elui-lo em 30 μL de tampão de eluição (EB). Fosforilar e recoze frente guia Primer_3 e reverter guia Primer_3. Adicionar 0,5 μL de 100 μM em frente guia Primer_3, 0,5 μL de 100 μM reverter guia Primer_3, 5 μL de tampão, ligase x T4 10, 1 μL da quinase de polinucleotido T4 e 43 μL de H2O para um tubo PCR. Adicione 5 μL de tampão, ligase x T4 10, 1 μL da quinase de polinucleotido T4 e 44 μL de biologia molecular-classe H2O, em um segundo tubo PCR.Nota: Isto servirá como controlo negativo. Incube as misturas de reação em um thermocycler a 37 ° C por 30 min, em seguida a 95 ° C por 5 min. Arrefecer a mistura à taxa de rampa mais lento a 16 ° C para recozer os, oligos. Em seguida, coloque a mistura de oligo recozido a 4 ° C. Ligam os oligos recozido em digerido pv1524 da etapa 1.4.3. Adicione o seguinte para um tubo PCR: 1 μL de tampão de ligase x T4 10, 0,5 μL de T4 DNA ligase, 0,5 μL de mistura de oligo recozido, digerido CIP-tratados purificado do plasmídeo (20 – 40 ng) e H2O para um volume total de 10 μL. Adicione o seguinte para um tubo PCR: 1 μL de tampão, ligase 10 x T4, 0,5 μL de T4 DNA ligase, digerido vector purificada CIP-tratados (20 – 40 ng), 1 μL de mistura de controlo negativo e H2O até um volume total de 10 μL. Incubar ambos os tubos em um thermocycler a 16 ° C por 30 min, em seguida, a 65 ° C por 10 min, em seguida, fixe a 25 ° C. Transforme quimicamente competentes Escherichia coli DH5α usando um protocolo de transformação de choque de calor padrão 5 μL da mistura da ligadura. Selecione na mídia LB Amp/Nat (200 μg/mL Amp, Nat de 50 μg/mL).Nota: Para selecionar o pV1524 e seus derivados na mídia de seleção dupla resultará em perda de módulo Nat/CaCas9/guia por excisão FRT/FLP em bactérias. Purificar os plasmídeos de quatro transformants por miniprep e sequência da sequência de inserção com primer de sequenciamento (tabela 1).Nota: Na maioria das vezes, sequenciamento 4 transformants é suficiente para identificar pelo menos 1 clone correto. Salvar o plasmídeo que têm a sequência de RNA guia clonada uma única vez para o BsmBI corte local a-20 ° C. 2. concepção e geração de modelo de reparação Inserir um codão stop clicar na sequência do gene e adicionando nucleotídeos que codificam um stop códon e restrição digestão site (Figura 1tabela 1).Nota: A inserção irá interromper a sequência de PAM.Nota: Um site de digestão de restrição será incluído na sequência de modelo de reparação para facilitar a triagem eficiente dos clones (Figura 1). Clique esquerdo 10 bases a jusante de onde será feita a mutação e arrastar que o cursor 60 bases contra a corrente. Clique na guia para adicionar a primeira demão de primer. Isto irá adicionar reparação modelo Forward_3. Clique esquerdo 10 bases montante de onde será feita a mutação e arrastar que o cursor 60 bases a jusante. Clique na guia para adicionar a primeira demão de primer. Isto irá adicionar reparação modelo inverter 3. (Figura 1) Realize a extensão da primeira demão para gerar o modelo de reparação. Adicionar 1,2 μL de 100 μm reparação modelo para a frente da primeira demão, 1,2 μL de 100 μm reparação modelo reverso da primeira demão, 6 μL de deoxynucleotide trifosfatos (dNTPs) (total concentração 40 mM), 6 μL de tampão, 0,6 μL da Taq polimerase (3 unidades) e 45 μL de H2O para cada um dos 4 PCR tubos. Realizar a extensão da primeira demão executando entre 20 e 30 rodadas do PCR. Condições de extensão exemplo: 2 min a 95 ° C, (30 s a 1 min a 50 ° C, a 1 min a 68 ° C, 95 ° C) x 34, 10 min a 68 ° C. Combinar o conteúdo de todos os 4 tubos PCR em um tubo de 1,5 mL e usar um kit de purificação de PCR para purificar produtos em 50 μL de H2O. Dosar os produtos de extensão da primeira demão para garantir suficiente DNA determinando a absorvância a 260 nm.Nota: Concentração final típica do produto extensão da primeira demão é ~ 200 – 300 ng / µ l. 3. transformação de c. albicans com modelo de reparação e plasmídeo Acetato de lítio e TE de fazer. Mix 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, acetato de lítio de 100 mM e H2O (pH de solução-mãe todos os 7,5) para atingir o volume total de 50 mL. Faça a placa Misture 40% PEG 3350, acetato de lítio 100 mM, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA e H2O (pH de solução-mãe todos os 7,5) para atingir o volume total de 50 mL. Digeri corretamente clonado plasmídeos da etapa 1.9. Adicionar 10 μg de plasmídeo, 4 µ l de tampão 10x, 0,4 µ l de 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA), 0,5 µ l de KpnI, 0,5 µ l de SacI e H20 a 40 µ l total de volume em um tubo de 1,5 mL. Incube a 37 ° C durante a noite (Figura 1). Cresce uma cultura durante a noite de SC5314 de c. albicans , selvagem-tipo prototroph, a 25 ° C em dextrose de peptona levedura suplementado com 0,27 mM uridina (YPD + Uri), idealmente a OD600 inferior a 6. 5 unidades de600 OD de células por transformação de pelotas por fiação durante 5 min à 2.348 x g e suspender o OD 5600 de células peletizadas em acetato de lítio e TE 100 µ l. Adicione o seguinte para um tubo de 1,5 mL na ordem listada: 1) 100 µ l de células da etapa 3.4.1, 2) 40 µ l de esperma salmão cozida e refrigeração rápida DNA (10 mg/mL), 3) 10 µ g de digestão de plasmídeo da etapa 3.3.1, 4) 6 µ g de reparação purificada modelo e 5) 1 mL de placa. Adicione o seguinte para um tubo de 1,5 mL na ordem listada: 1) 100 µ l de células, 2) 40 µ l de esperma de salmão cozida e refrigeração rápida DNA (10 mg/mL), volume de2O 3) H igual ao de transformar o DNA em passo 3.5 e 4) 1 mL de placa.Nota: Isto irá servir como um controle negativo. Misture as transformações suavemente pipetando e deixe incubar a 25 ° C durante a noite. As células de choque de calor, colocando-os em um banho de água de 44 ° C durante 25 min. Gire por 5 min a 2.348 x g em uma centrífuga de bancada e retire a placa de mistura sobrenadante. Lave uma vez com a adição de 1 mL de YPD + Uri e centrifugar novamente por 5 min a 2.348 x g. Suspender as células em 0,1 mL de YPD + Uri e incubar um tambor rolo ou agitador a 25 ° C durante a noite. Placa em YPD + Uri com 200 μg/mL de nourseothricin. Colónias aparecerá em 2-5 dias. 4. estrias para colônias única Dividir uma 100 x 15 mm placa de Petri em trimestres e etiquete cada quadrante. Toca uma das colónias da placa com um palito de dente estéril ou aplicador e raia de transformação em todo o lado mais comprido do quadrante. Despir-se para colônias simples usando uma técnica asséptica e permitir que as colônias a crescer a 30 ° C durante 2 dias. 5. colônia do PCR Desenha os cheque para a frente da primeira demão (FCP) ~ 200 pares de bases montante do site da restrição que foi introduzido e as seleção inversa da primeira demão (RCP) ~ 300 pares de bases a jusante. Adicione 0.3 μL do FCP, 0.3 μL de RCP, 0.3 μL de polymerase thermostable (ExTaq 1.5 unidades), 3 µ l de dNTPs (total concentração 40 mM), 3 μL de tampão de ExTaq e 23 μL de H2O para um tubo de 1,5 mL.Nota: Adição de 0,5 μL/reação dimetil sulfóxido (DMSO) pode melhorar a eficiência do PCR. Adicione 0,25 μL de uma colônia de levedura única da etapa 4.1.2 à mistura da etapa 5.1.1, usando a ponta da pipeta P10 e tomando cuidado para não perturbar o ágar-ágar. Amplificar DNA por PCR e executar 5 μL de PCR em um gel para garantir a amplificação é bem sucedida, tendo cuidado para não perturbar o centrifugado na parte inferior do tubo. 6. restrição digestão de PCR de colônia Adicionar 10 μL de produto (tomando cuidado para não não perturbe o centrifugado na parte inferior do tubo) PCR, 3 μL de tampão, 1 μL de enzima de restrição e 16 μL de H2O, em seguida, incube-se de acordo com as instruções do fabricante e resolver em um gel de agarose para identificar corre edições do genoma de CT.Nota: A enzima de restrição usada aqui é o site codificado no modelo de reparação específica de TPK2 . 7. salvar cepas Crescer uma cultura da noite das colônias que foram confirmadas pela digestão da limitação em YPD + Uri a 30 ° C. Adicione 1 mL da cultura e 1 mL de glicerol a 50% (trazendo a concentração final de glicerol a 25%) para um tubo adequado para armazenamento a-80 ° C. Armazenar os clones corretos a-80 ° C.Nota: Estirpes corretas podem ser armazenadas a-80 ° C por muitos anos. 8. remoção de Natr marcador Raia transformantes correto em maltose de peptona levedura (YPMaltose) (2% maltose). Escolher uma colônia da placa de listras e cultura o fermento por 48 h a 30º C no líquido YPMaltose maltose de 20 g/L. 200 – 400 células em maltose de 20 g/L de YPMaltose da placa e incubar a 30 ° C por 24 h. Replicar a placa sobre YPMaltose e YPMaltose 200 μg/mL NAT. Incube a 30 ° C por 24 h.Nota: Colônias que já não crescem em YPMaltose 200 μg/mL nourseothricin mas crescem na YPMaltose perderam o Natr marcador (CaCAS9) e guia de RNA. Salve as estirpes que perderam o Natr marcador (CaCAS9) e guia do RNA como feito em etapas 7.1 – 7.3.Nota: Um plasmídeo semelhante, pV1393, usa o SAP2 em oposição a um promotor MAL2 . Crescimento no YCB – BSA irá induzir flipase e remoção de Natr se pV1393 é usado para edição de gene.