Biz beyin dokusunun elektron mikroskobu araştırmalar için yeni iş akışı tanıtmak. Yöntemi tarafsız bir biçimde nöronal özelliklerini incelemek kullanıcı sağlar. Elementel analiz için Ayrıca randomize örnekleme için iş akışı çoğu automatizes bir script mevcut.
Araştırmalar neurons ve onların sinapslarda ultrastructural özelliklerinden sadece elektron mikroskobu ile mümkündür. Özellikle yoğunlukları değişiklikleri karşılaştırmalı çalışmalar ve dağılımları gibi özelliklerin, yansız örnekleme iletişim kuralı için güvenilir sonuçlar önemlidir. Burada, beyin örnekleri resim alma için iş akışı mevcut. İş akışı tanımlı beyin bölgesi içinde sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme sağlar ve görüntüleri bir disector kullanılarak analiz edilebilir. Bu teknik çok seri bölümler kapsamlı sınav hızlıdır ancak hala yoğunlukları ve ultrastructure özellikleri dağılımları tahmin etmek için uygun bir yaklaşım sunuyor. Katıştırma önce lekeli vibratome bölümleri, soruşturma, hangi yardım hız yukarıya genel numune hazırlama süreci altında beyin bölgesi tanımlamak için bir referans olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım bir zenginleştirilmiş-konut çevre ultrastructural parametrelerinde birkaç fare beyin etkisini araştıran karşılaştırmalı çalışmalar için kullanıldı. İş akışı başarılı kullan seçeneğine göre biz beyin örnekleri elementel analiz amacıyla uyarlanmış. İletişim kuralı kullanıcı etkileşimi zaman açısından en iyi duruma getirilmiş. Açık kaynak yazılım SerialEM için bir komut dosyası derleme tarafından zaman alıcı adımlar otomatikleştirme kullanıcı temel haritalar edinme ana çalışmalarına odaklanmaya yardımcı olur. Orijinal iş akışı olduğu gibi biz güvenilir sonuçlar güvence altına almak için yansız örnekleme yaklaşım dikkat.
Elektron mikroskobu, bölümler içindeki temsilcisi bölgeleri örnek için zordur. Biz, bir gözlemci olarak, sık sık belirli bölgeler dikkatimizi örnek, göze çarpan özellikleri tarafından çizilmiş bakmak için de dağıtılmış, yansız örnekleme önleme önyargılı vardır. Bölgenin ilgi bir her parçası bir elektron test1‘ bitiş yukarıya aynı şansı olursa önyargı örnekleme yalnızca önlenebilir. Örneğin, bir yazılım çözümü önyargısız örnekleme mikroskop trackball el ile sahne durur her yerde örnekleme bölgeleri seçin için belgili tanımlık imge vasıl bakmadan iterek önlemek mümkündür. Ama net olarak söylemek gerekirse, bu rasgele bir yordam, çünkü, bilinçli ya da bilinçsizce, kullanıcı hareket sahne alanı üzerinde bir etkisi olabilir ve ayrıca, örnekleme bölgeleri seçme sofistike bir yolu bu değil, değil. Rastgele örnekleme çiftleri bölümlerden kesitler, bilinen mesafe çiftlerini gerektiren stereology1için belirli birimlerdeki, örneğin, yapılarının sayısını değerlendirmek için kullandıysanız özellikle önem kazanmaktadır. Ayrıca yalnızca tek bir bölümüne bakın ve belirli yapılara2sayısını tahmin etmek mümkün olurdu, ama çok küçük yapılardır sürece bu yaklaşım ile müfettişler sayısal yoğunluğu büyük yapıların abartma eğilimindedir karşılaştırma bölümü kalınlığında. Alternatif yaklaşımlar seri bölümlerden doku birimleri yeniden ve böylece3istenen verileri almak üzeresiniz. Ama bu çok zaman alıcı ve (daha büyük) karşılaştırmalı çalışmalar için uygun bir yaklaşım değil.
Bu sorunların üstesinden gelmek için araştırmacı örnekleri elektron Filmler, ultra-ince kesitler içinde normal aralığı elde etmek için otomatik olarak seçmesine olanak sağlayan bir iş akışı geliştirdik. Elektron Filmler rasgele, yansız örnekleme izin konumudur. Uygun yaklaşımdır yapıları (örneğin, sinapslarda içinde bir belirli neuropil cilt4,5) sayısal yoğunluğu ve yapısal özellikleri (örneğin, genişliğini sinaptik yarık boyutlarının belirlenmesi için her ikisi de veya çap postsinaptik yoğunluğu4,5)
İş akışı özel yapım bir rasgele noktası otomatik olarak önceden tanımlanmış bir bölgesi içinde kılavuz pozisyonların Ultra-ince bir bölümü ilgi hesaplar (RPS) yazılımı (bizim mikroskopla sağlanan komut dosyası oluşturma yazılımını kullanarak Java komut dosyasında yazılmıştır) örnekleme kullanır. Böylece bir elektron test her noktada yapılan RPS yazılım elektron mikroskobu aşaması önceden tanımlanmış bu noktalara taşır. İlk olarak, kullanıcı ilgi ince bölümünde bir bölge tanımlar. Daha sonra RPS yazılım bu bölge içerisinde kılavuz pozisyonlar hesaplar. X / ilk konumda y koordinatlarını rasgele oluşturulur ve kalan pozisyonlar açısından ilk pozisyonu normal kılavuz aralıklarla yerleştirilir. Bölgenin ilgi bir her parçası muayene ediliyor aynı şansı olduğundan, bu en düşük düzeyde veri toplama sağlar. Bu yaklaşım örnekleme da sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme denir (bkz: başvuran6,7 daha fazla ayrıntı için).
Sayısal yoğunluğu yapıları belirlemek için bilinen uzaklıkta mı bölümleri çiftiyle çalışıyoruz. Bir elektron test önceden belirlenmiş pozisyonların birinde ilk bölümünden elde ettikten sonra TEM seri bölümü yazılım (bizim elektron mikroskobu ile sağlanan yazılım paketinin bir parçası) ikinci bölümünde, karşılık gelen nokta için taşır bir elektron test karşılık gelen konum elde etmek. Bu önceden belirlenmiş kılavuzunda her konum için tekrarlanır. Bizim yaklaşım, bir disector elektron Filmler8,9her çifti parçacıkları saymak için kullanılır. Bir disector bir çift sayma kare, her bölüm8,9için oluşur. Nesneleri sayısal yoğunluğu yalnızca nesneleri görünür sayılarak belirlenir ilk bölüm (veya başvuru bölümü) ama ikinci bölüm (veya arama bölümüne) üzerinde. Bu nesnelerin bir hızlı ve verimli bir şekilde8,9sayısal yoğunluğu tahmin etmek için sağlar. Ayrıca tek bölümlerde iki boyutlu yapısal özellikleri ölçülebilir.
Başarıyla hipokampüs synapse sayılarda enriched çevre (EE) koşulları koşulları4,5konut standart ortamına (SE) göre konut maruz farelerin farklılıkları değerlendirmek için bu iş akışını uygulamış olan, ve aynı zamanda vahşi türü (WT) fareler ve peptit Y (NPY) KO fareler ultrastructural farklılıkları değerlendirmek için SE ve EE5altında tuttu. Hedefimiz nöronların, sayısal sinaptik yoğunluğu gibi yapısal özellikleri itibariyle özellikle kesit aktif bölgesinde ve postsinaptik yoğunluğu, sinaptik yarık ve sinaptik veziküller sayısı genişliğini uzunlukları aramak oldu, nöronal bağlantısı ve etkinleştirme farklı deneysel koşullar arasında değişiklikleri değerlendirme için. Buna ek olarak, nöronlar belirli bir beyin alanda saklı nöropeptitler miktarını belirlemek için yoğun çekirdekli veziküller (DCV) sayısal yoğunluğu içinde ilgilenmişlerdir.
Bizim yaklaşım yukarıda bizim sonraki adımda açıklanan Etütler başarısı göre insan beyni örnekleri içinde tarafsız elemental analizler için alanlar seçmek için bizim iş akışı adapte olması. Bu nöronlar ve gliyal hücreler ferritin molekülleri depolanan görüntü demir için yapılmıştır. Bunun için biz bize bir rasgele tarama süreci işlemlerinde tanımlanmış bir alanı beyin bölümlerinin çoğunu otomatikleştirmek izin verilen bir komut dosyası derlenmiş.
Burada sunulan iş akışı araştırmacı tarafsız bir biçimde ultrastructural özellikleri üzerinde veri almak sağlar. Bu çok daha az zaman alıcı birim soruşturma seri bölümlerden daha var. Bu hedefe ulaşmak için birkaç farklı uygulamaları kullanılır. (Kullanılabilirlik, lütfen iletişim için karşılık gelen yazar) ilk başta bir rasgele sahne-örnekleme alanı koordinatları seçmek için üst karakter tanıtmak için ısmarlama RPS yazılımımız kullanılır. Bu yatırım Getirisi sistematik bir üniforma rastgele örnekleme sağlar. Daha sonra belirli yapıları sayımlarda biz nerede 2 ardışık bölümlerde bilinen mesafe ile karşılaştırılır, biz kullanılan önceki çalışmalar13,14,15 ‘ e göre yeni bir yol disector yöntemi adapte bizim özel yapım RPS yazılım sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme için. Bu 3D yeniden inşa seri bölümler tüm birimlerden karşılaştırıldığında zaman kazandırır. Özel yapım RPS yazılım özellikle mikroskop iş akışı çoğaltılması için kısıtlayıcı bir faktör olan bir tür için geliştirilmiştir. Bu özel yazılım bir alternatif komut dosyalarına izin veren ve diğer mikroskop modelleri ile uyumlu bir uygulama olacaktır.
Biz başarıyla kullanılan bu yaklaşım için bizim karşılaştırmalı çalışmalar4,5. Ultra-ince kesitler nöronal doku, ilgi alanı özetlenen ve görüntüleri bu alanda sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme tarafından alındı. Bu ilgi, dentat gyrus polimorf tabakası alanı olan yaklaşımımız için yararlı olabilir araştırmak için oldukça küçük bir alan olduğunu belirtmek zorunda. Rastgele yerleştirilmiş bir disector içinde DCV sayısı değerlendirildi ve birkaç ultrastructural şekil-in yetişkin fareler DGpl sinapslar SE ve EE yanı sıra yetişkin WT yetişkin NPY nakavt fareler ve fareler yer alır. Yaklaşımımız, toplanan veri değişiklikleri incelenen parametrelerden bazıları gösterdi. Bu bulgular Juvenil hayvanlar2benzer diğer çalışmalarda olanlardan doğruladı.
Bir dezavantajı bu iş akışının deneysel kullanım kullanıcılar (bizim durumumuzda, kullanıcı arabirimi, TEM seri bölüm farklı arayüzü ile rahat olsun gerek bu multi-application-yaklaşım kullanım kolaylığı açısından ideal olmadığını olabilir RPS yazılım ve SerialEM yazılım). Tüm uygulamaları verimli bir şekilde işlemek öğrenme zaman alıcıdır ve dikkate alınmalıdır. Ancak, bu iş akışıyla kullanmak öğrenme zaman yatırım hala seri bölümü TEM ile tüm birimleri çözümlemek için gereken zaman içinde açıkça olumlu. Güvenilir veri1 bölüm/birim yüksek miktarda araştırmak gerek kalmadan sunmak için yeterli ilgi alanında sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme tarafından yerleştirilen bir disector kullanma yöntemidir.
Doku ve yapıların korunması sadece ilgi alanı belirsizliğe yer bırakmadan tanımlayan için de yapısal özelliklerini değerlendirmek için çok önemli değil gibi çalışmalarımız sonucu en üst düzeye çıkarmak için numune hazırlama sırasında kendine iyi bak hayati oldu. Çok önemli bir faktör ve bu yöntemin belki başka bir dezavantajı olduğunu kaliteli Ultra-ince kesitler çiftlerinin gereklidir: hiçbir delik veya birini kullanarak bölümleri soruşturma altında alanı kapsayacak kırışıklıkları olmalıdır ve bölüm kalınlığı olmalıdır homojen yapılmaktadır. Araştırmacı ultramicrotomy, iyi eğitilmiş olmalı. Bakımı da bu bölümleri elektron ışını zarar duyarlıdır ve kolayca altını üstüne gibi TEM bölümlerde Imaging gerçekleştirilecek var. Ayrıca, doğru numarayı örnekleme alanların yatırım Getirisini seçmek önemlidir. Bağlı olarak deneysel amacı, dikkatli bir şekilde ayarlanması büyütme oranını elektron filmler var. Bizim deneyler için özel olarak, merkezi sinir sistemindeki sinapslar sayma 20 bir bölümünde ilgi 30,25 µm2 alana sahip en iyi bölgeleridir. Bu su kuyusu içinde güvenilir sonuçlar elde etmek için (bizim durumda sinapslarda, sinaptik özellikleri ve DCV) söz konusu özellikleri tanıma personel yetiştirmek için tavsiye edilir. Sinapsların tanımlamak için sinaptik veziküller tanımlanabilir olmalıdır ve bu en az 10 çözümlenmesini gerektiren nm. Bunun için 5000 X büyütme en uygun olan ama büyütmeyi kamera konumunu ve türü gibi donanım parametreleri bağlıdır ve diğer mikroskop ve/veya fotoğraf makinesi türleri için adapte etmesi gerekir belirtmek gerekiyor. Ayrıca protokol uygulamaları özel bir TEM için kullanır ve kullanıcıların diğer modelleri ile Kur farklılıkları göz önünde bulundurmanız gerekir kaydetti vardır.
Biz (bir TEM yüksek çözünürlüklü gerektiğinde) araştırma soru sistematik bir üniforma talepleri bizim iş akışı sadece nörolojik ama biyolojik bilim ve malzeme bilimi geniş bir alanda pek çok diğer uygulamalar için adapte edilebilir inanıyorum rastgele örnekleme ve muayene için örnekler miktarını sorar zamanı bir verimli şekilde analiz için. Örneğin, biz şu anda demir depoları insan beyninin yerelleştirme ilgilendi. Bunun için biz son zamanlarda bizim iş akışı, ultra-ince bölümlerinde rasgele seçilmiş bölgelerde elementel analiz etkinleştirmek için adapte edilmiştir. İş akışı için gerekli olan uygulama sayısını en aza indirmek için rasgele bir biçimde seçilebilir noktaları önceden belirtmek üzere sahne alanı taşımak için programlanabilir çünkü yalnızca, SerialEM yazılımı kullanarak geçerli amaçladık. Biz iş akışını tamamen automatizing amacı ile TEM denetlemek için özel komut dosyaları oluşturdu. Bu tatmin edici sonuçlar vermemiştir filtre uygulanmış görüntüleme modunda autofocusing dışında mümkün olmuştur. Böylece DM yazılım odaklanarak ve enerji filtre görüntüleri elde etmek için kullanılır.
Özetle, biz elektron Filmler tarafsız bir şekilde elde etmek yardımcı yazılım çözümleri sunuyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Avusturyalı Bilim Fonu, FWF, proje numarası P 29370 B27 tarafından finanse
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |