نقدم سير عمل جديدة للتحقيقات الميكروسكوب الإلكتروني لانسجة المخ. الأسلوب الذي يسمح للمستخدم بدراسة ملامح العصبية بطريقة غير متحيزة. لتحليل عنصري، نقدم أيضا البرنامج نصي الذي أوتوماتيزيس معظم سير العمل لأخذ العينات العشوائية.
تحقيقات الميزات ultrastructural من الخلايا العصبية وهذه الاشتباكات العصبية الوحيدة الممكنة مع الميكروسكوب الإلكتروني. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة للتغيرات في كثافة وتوزيع هذه الميزات، على بروتوكول أخذ عينات غير منحازة أمر حيوي لنتائج يمكن الاعتماد عليها. نقدم هنا، سير عمل للحصول على صورة عينات المخ. سير العمل يسمح منهجية موحدة عينة عشوائية داخل منطقة محددة من الدماغ، ويمكن تحليل الصور باستخدام ديسيكتور. هذا الأسلوب هو أسرع بكثير من دراسة مستفيضة لمقاطع المسلسل ولكن لا يزال يقدم نهجاً عمليا لتقدير كثافة وتوزيعات من ميزات أولتراستروكتوري. قبل الدمج، استخدمت أقسام فيبرتوم الملون كمرجع لتحديد منطقة الدماغ قيد التحقيق، الذي ساعد في تسريع إعداد العينة الإجمالية عملية. تم استخدام هذا النهج للدراسات المقارنة للتحقيق في تأثير بيئة الإسكان أثرت على العديد من المعلمات ultrastructural في الدماغ الماوس. استناداً إلى الاستخدام الناجح لسير العمل، يمكننا تكييفه غرض عنصري تحليل العينات الدماغ. نحن الأمثل في البروتوكول من حيث الوقت لتفاعل المستخدم. أتمتة جميع الخطوات التي تستغرق وقتاً طويلاً بترجمة البرنامج نصي لبرمجيات المصدر المفتوح سيرياليم تساعد المستخدم على التركيز على العمل الرئيسي للحصول على خرائط عنصري. كما هو الحال في سير العمل الأصلي، ونحن اهتماما للنهج الذي أخذ العينات غير منحازة لضمان نتائج موثوقة.
في المجهر الإلكتروني، أنها غالباً ما تشكل تحديا للعينة المناطق تمثيلاً داخل الأقسام. ونحن، كمراقب، غالباً ما متحيزة لإلقاء نظرة على مناطق محددة يسترعى انتباهنا بميزات واضحة للعينة، منع توزيعها جيدا وغير متحيز لأخذ عينات. أخذ العينات التحيز يمكن فقط تجنب إذا كان كل جزء من المنطقة لمصلحة يحصل على نفس الفرصة لينتهي بهم المطاف في صورة مجهرية إلكترون1. من الممكن تجنب التحيز أخذ العينات دون حل برمجيات، على سبيل المثال، عن طريق دفع trackball المجهر يدوياً دون النظر في الصورة، بغية تحديد مناطق أخذ العينات أينما توقف المرحلة. ولكن المعني الدقيق للكلمة، ويرجع عدم إجراء عشوائي، عمدا أو لا شعوريًا، المستخدم يمكن أن يكون لها تأثير على حركة المسرح، وعلاوة على ذلك، هذه ليست طريقة متطورة لتحديد مناطق أخذ العينات. أخذ عينات عشوائية يصبح أهمية خاصة في حالة استخدام أزواج من المقاطع لتقييم العدد الهياكل في حجم معين، على سبيل المثال، ستيريولوجي1، الأمر الذي يتطلب أزواج من المقاطع، مسافة معروفة وبصرف النظر. من الممكن أيضا ننظر فقط في قسم واحد وتقدير عدد2من هياكل محددة، ولكن مع هذا النهج المحققين يميلون إلى المغالاة في تقدير الكثافة العددية للهياكل الكبيرة، إذا لم تكن الهياكل صغيرة جداً في مقارنة سمك مقطع. هي نهج بديلة لإعادة بناء كميات من الأنسجة من مقاطع المسلسل وهكذا الحصول على البيانات المطلوبة3. ولكن هذا هو المستهلكة للوقت جداً وليس نهجاً عمليا للدراسات المقارنة (أكبر).
للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير سير عمل الذي يسمح للباحث تلقائياً تحديد العينات للحصول على ميكروجرافس إلكترون في المباعدة بين الولادات العادية داخل أقسام رقيقة جداً. وموقف ميكروجرافس الإلكترون عشوائي، مما يتيح أخذ العينات غير متحيزة. والنهج مناسبة سواء بالنسبة لتحديد الكثافة العددية لهياكل (على سبيل المثال، نقاط الاشتباك العصبي داخل بعض نيوروبيل حجم4،5)، والأبعاد للسمات الهيكلية (على سبيل المثال، عرض المشقوق متشابك، أو القطر من4،بوستسينابتيك الكثافة5).
سير العمل يستخدم نقطة عشوائية مصنوعة خصيصا أخذ العينات (RPS) البرمجيات (كتب في جافا سكريبت استخدام البرمجيات البرمجة النصية المتوفرة مع لدينا المجهر) الذي يقوم تلقائياً بحساب مواقع الشبكة داخل منطقة محددة مسبقاً للفائدة في قسم رقيقة جداً. ينقل البرنامج RPS مرحلة المجهر الإلكتروني إلى هذه النقاط المحددة مسبقاً، حتى يمكن إجراء صورة مجهرية الإلكترون في كل نقطة. أولاً، تعريف المستخدم منطقة الاهتمام داخل قسم رقيقة. بعد ذلك، يحسب البرنامج RPS مواقع الشبكة داخل هذه المنطقة. X/y إحداثيات المركز الأول يتم إنشاؤها عشوائياً، ويتم وضع الوظائف المتبقية على فترات منتظمة الشبكة فيما يتعلق بالمركز الأول. لأن كل جزء من المنطقة لمصلحة له نفس الفرصة ليجري بحثها، وهذا ما يسمح جمع الحد الأدنى من البيانات. ويسمى هذا النهج لأخذ العينات أيضا منهجية موحدة عينة عشوائية (انظر مراجع6،7 لمزيد من التفاصيل).
لتحديد الكثافة العددية للهياكل، ونحن نعمل مع أزواج من المقاطع عن بعضها مسافة معروفة. بعد الحصول على صورة مجهرية إلكترون من المقطع الأول في واحدة من مواقف محددة سلفا، “قسم المسلسل تيم” البرمجيات (جزء من المجموعة من البرامج المتوفرة مع المجهر الإلكتروني لدينا) ينتقل إلى النقطة المقابلة في القسم الثاني، ومن أجل الحصول صورة مجهرية إلكترون من موقع المقابلة. ويتكرر هذا لكل موقع في شبكة محددة سلفا. في نهجنا، يستخدم لحساب عدد الجسيمات في كل زوج من الإلكترونات ميكروجرافس8،9ديسيكتور. ديسيكتور يتكون من زوج من الإطارات العد، واحد لكل8،الباب9. تتحدد الكثافة العددية للكائنات فقط عد الكائنات المرئية على القسم الأول (أو قسم المراجع) ولكن ليس على القسم الثاني (أو قسم البحث). وهذا يسمح بتقدير الكثافة العددية للكائنات ب طريقة سريعة وفعالة8،9. بالإضافة إلى ذلك على أبواب واحدة، يمكن قياس السمات الهيكلية ثنائي الأبعاد.
وقد طبقنا سير العمل هذا بنجاح لتقييم الاختلافات في الأرقام المشبك في الحصين الفئران المعرضة إلى بيئة المخصب (EE) مقارنة ببيئة القياسية (SE) الإسكان شروط4،5، ظروف السكن وأيضا تقييم الاختلافات ultrastructural بين نوع البرية (WT) الفئران والفئران neuropeptide Y (نبي) كو أبقى تحت سراج الدين وهه5. وكان هدفنا إلقاء نظرة على وجه التحديد على السمات الهيكلية للخلايا العصبية، مثل الكثافة العددية متشابك، الأطوال من منطقة نشطة في المقاطع العرضية وكثافة بوستسينابتيك، وعرض المشقوق متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك، من أجل تقييم التغييرات في اتصال الخلايا العصبية وتنشيط بين ظروف تجريبية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، نحن مهتمون في الكثافة العددية من حويصلات كثيفة الأساسية (DCV) في الخلايا العصبية لتحديد مقدار neuropeptides المخزنة في منطقة معينة في الدماغ.
استناداً إلى نجاح النهج الذي نتبعه للدراسات المذكورة أعلاه، في خطوتنا القادمة، أننا قد تكيفت لدينا سير العمل لتحديد مجالات لإجراء تحاليل عنصري غير متحيز داخل عينات المخ البشري. وقد تم ذلك بصورة الحديد، التي يتم تخزينها في جزيئات فيريتين في كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. لهذا، نحن ترجمة البرنامج نصي الذي يسمح لنا بأتمتة معظم العمليات لعملية فحص عشوائي لأقسام الدماغ في منطقة محددة.
سير العمل المقدمة هنا يسمح للباحث للحصول على البيانات على ميزات ultrastructural بطريقة غير متحيزة. وهذا وقتاً أقل بكثير من حجم التحقيقات من مقاطع المسلسل. وتستخدم العديد من التطبيقات المختلفة لتحقيق هذا الهدف. في البداية، برنامجنا RPS مصنوعة خصيصا (للاطلاع على تفاصيل بشأن توافر، الرجاء الاتصال بكاتب المقابلة) ويستخدم لإدخال تحولاً مرحلة عشوائية لتحديد إحداثيات المنطقة أخذ العينات. وهذا ما يسمح عينة عشوائية منهجية موحدة للعائد على الاستثمار. المقبل، لعد هياكل محددة، نحن تكييف طريقة ديسيكتور، حيث مقارنة المقاطع على التوالي 2 مع المسافة المعروفة، بطريقة رواية مقارنة بالدراسات السابقة13،،من1415 كما كنا نحن البرمجيات RPS مصنوعة خصيصا لمنهجية موحدة عينة عشوائية. وهذا يوفر الوقت بالمقارنة مع 3D تعمير وحدات تخزين كاملة من مقاطع المسلسل. على وجه التحديد هو تطوير هذا البرنامج RPS مصنوعة خصيصا لنوع واحد من المجهر الذي يعتبر عاملاً مقيداً لاستنساخ سير العمل. بديل من هذا البرنامج محددة سيكون تطبيق الذي يسمح البرمجة النصية وهو متوافق مع نماذج أخرى المجهر.
أننا استخدمت بنجاح هذا النهج لأن الدراسات المقارنة4،5. في أقسام رقيقة جداً من الأنسجة العصبية، كان مجال الاهتمام والصور التي اتخذتها المنتظمة عينة عشوائية موحدة في هذا المجال. قد تجدر الإشارة إلى أن مجال الاهتمام، طبقة polymorph المغزلي المسنن، منطقة صغيرة بدلاً من ذلك التحقيق الذي قد يكون مفيداً للنهج الذي نتبعه. داخل ديسيكتور موضوعة عشوائياً، يمكننا تقييم عدد DCV والعديد من الميزات ultrastructural من نقاط الاشتباك العصبي في دجبل الفئران الكبار يوجد في سراج الدين وهه فضلا عن وزن البالغين الفئران مقابل الفئران خروج المغلوب نبي الكبار. باستخدام النهج الذي نتبعه، أظهرت البيانات التي تم جمعها تغييرات في بعض المعلمات التحقيق. وأكدت هذه النتائج تلك من دراسات أخرى مماثلة في الحيوانات الأحداث2.
عيوب استخدام تجريبي لسير العمل هذا قد يكون أن هذا المتعددة application النهج ليس مثاليا من حيث سهولة الاستخدام، المستخدمين بحاجة للحصول على راحة مع واجهات المستخدم مختلفة (في حالتنا، واجهة المستخدم، و “قسم المسلسل تيم” ، RPS البرمجيات، والبرمجيات سيرياليم). تعلم كيفية التعامل مع جميع الطلبات بطريقة فعالة هو مضيعة للوقت وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. ومع ذلك، استثمار الوقت في تعلم كيفية استخدام سير العمل هذا لا تزال وضوح مواتية مع مرور الوقت اللازم لتحليل وحدات التخزين كله مع قسم المسلسل تيم. طريقة استخدام ديسيكتور بمنهجية أخذ العينات العشوائية موحدة في مجال الاهتمام كافية لتقديم بيانات موثوقة1 دون الحاجة إلى التحقيق على كمية عالية من الأقسام/وحدة التخزين.
لتحقيق أقصى قدر من النتائج في دراساتنا، من الضروري اتخاذ الرعاية الجيدة أثناء إعداد عينة، كالحفاظ على الأنسجة والهياكل ليست فقط أمرا حاسما لتقييم السمات الهيكلية، بل أيضا لتحديد مجال الاهتمام لا لبس فيه. عاملاً محوريا، وعيب آخر ربما كان هذا الأسلوب، أن جودة عالية لأزواج مقاطع رقيقة جداً مطلوب: يجب أن يكون هناك لا ثقوب أو التجاعيد التي تغطي المنطقة الخاضعة للتحقيق في أي من الأقسام، ويجب أن يكون سمك الفرع تحتفظ متجانسة. الباحث يجب أن يكون المدربين تدريبا جيدا في أولتراميكروتومي. أيضا الرعاية التي يجب اتخاذها عند تصوير المقاطع في ال، كما المقاطع حساسة لأضرار شعاع الإلكترون ويمكن أن تمزق بسهولة. وعلاوة على ذلك، من المهم أن تختار العدد الصحيح من مناطق أخذ العينات في العائد على الاستثمار. وقد تكبير ميكروجرافس إلكترون تبعاً لهدف التجريبية، يحدد بدقة. لتجاربنا على وجه التحديد، عد نقاط الاشتباك العصبي في الجهاز العصبي المركزي، 20 المناطق ذات الاهتمام في مقطع واحد مع مجال 30.25 ميكرومتر2 الأمثل. فإنه ينصح تدريب جيد في الاعتراف بالميزات المذكورة (في حالة الاشتباكات العصبية وميزات متشابك و DCV) للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. الحويصلات متشابك بغية تحديد نقاط الاشتباك العصبي، يجب أن تكون قابلة للتحديد، وهذا يتطلب قرارا من مالا يقل عن 10 نانومتر. لهذا، بير 5000 X الأمثل، ولكن يمكن ملاحظة أن التكبير يعتمد على معلمات الأجهزة مثل النوع والموقف من الكاميرات، وسيكون من الضروري تكييف أنواع المجهر و/أو كاميرا أخرى. كما أنه تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يستخدم تطبيقات محددة لل واحد وأن يكون لدى المستخدمين مع نماذج أخرى للنظر في الاختلافات في برنامج الإعداد.
ونحن نعتقد أن لدينا سير العمل يمكن تكييفها للعديد من التطبيقات الأخرى ليس فقط في علم الأعصاب ولكن في مجال واسع من العلوم البيولوجية والعلوم المادية أيضا (عند الحاجة إلى دقة عالية) كلما كان السؤال البحثي يتطلب منهجية موحدة أخذ عينات عشوائية وكمية العينات لفحصها يسأل عن وسيلة فعالة لوقت للتحليل. على سبيل المثال، نحن مهتمون حاليا في إضفاء الطابع المحلي على مخازن الحديد في الدماغ البشري. لهذا، نحن تكيفت مؤخرا سير العمل لدينا، لتمكين تحليل عنصري على مقاطع رقيقة جداً في المناطق المختارة عشوائياً. من أجل تقليل عدد الطلبات اللازمة لسير العمل، ونحن تهدف إلى تطبيق باستخدام البرمجيات سيرياليم فقط، لأنه يمكن برمجتها للانتقال المرحلة المحددة مسبقاً النقاط التي يمكن تحديدها بطريقة عشوائية. قمنا بإنشاء برامج نصية مخصصة للتحكم ال، بهدف أوتوماتيزينج سير العمل تماما. أثبت ذلك عمليا باستثناء autofocusing في وضع التصوير التي تمت تصفيتها، والتي لم تسفر عن نتائج مرضية. وهكذا كنا البرمجيات مارك ألماني للتركيز، والحصول على الصور التي تمت تصفيتها الطاقة.
وباختصار، نحن نقدم حلول البرمجيات التي تساعد في الحصول على ميكروجرافس الإلكترون بطريقة غير متحيزة.
The authors have nothing to disclose.
تمويل من “صندوق العلوم النمساوية”، FWF، المشروع رقم B27 29370 ف
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |