Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür
Summary
Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).
Abstract
Burada açıklanan protokol, fare başına yaklaşık 30 x 106 canlı hücre sağlayan yetişkin dişi farelerden (54 ± 2 günlük) birincil keratinositlerin hasat ının güvenilir bir yöntemidir. Birincil yetişkin fare keratinositler dişi farelerin dorsal deriden hasat edilir. Erkek fareler (~6 haftalık) deneyin gereksinimlerine bağlı olarak keratinosit hasadı için kullanılabilir. Ötenazili fareler povione iyot ve etanol çözeltilerinde seri yıkAmalarla (%70 alkol) tıraş edilir ve sterilize edilir. Fareler dezenfekte edildikten sonra, sırt derisi çıkarılır ve deri altı yağ ve kas bir neşter ile kaldırılır ve atılır. Derileri küçük parçalar halinde kesilir ve epidermis alt dermis ayırmak için hafif, düşük sıcaklık trypsinization ile tedavi edilir. Kazınmış epidermises düşük hızda karıştırılır, tüyleri çıkarmak için filtre, sayılır, ve kültür ortamda yeniden askıya alınır. Bu yöntem birçok downstream uygulamaları için son derece culturable hücrelerin mükemmel bir tek hücreli süspansiyon sağlar.
Introduction
Memeli derisi tüm vücudu kaplar ve çok sayıda fonksiyona hizmet eder (örn. birincil fiziksel bariyer, sıcaklık regülasyonu ve nem tutma). Son 50 yılda, fare derisi üzerinde yapılan temel araştırmalar, cildin yapısı ve işlevi hakkında yeni bilgiler vermiştir. Fare derisi modeli büyük ölçüde kimyasal veya ultraviyole radyasyon kaynaklı karsinogenez karmaşık moleküler mekanizmaları arkasındaki temel biyoloji anlaşılmasına yardımcı oldu. Bu fare derisi modelleri insan cilt hastalıklarının anlaşılmasına ve hafifletilmesine önemli bir katkı sağlamıştır. Saç folikülü gelişim biyolojisi, kök hücre araştırmaları, karsinogenez ve epidermisin genetik keşfinde primer keratinositlerin daha fazla moleküler diseksiyonu araştırmak için, birincil epiteli izole etmek ve kültürü yapmak sıklıkla arzu edilir. in vivo deneylere paralel olarak kullanmak için fare derisinden keratinositler. Bu yöntemin geliştirilmesinde motive edici faktör klonojenik epidermal ve saç folikülü kök hücreleri 1 için bir in vitro tsay ihtiyacı oldu1,2. Klojen tahliller için uygun epidermal hücrelerin tek hücreli süspansiyonlar için acil bir ihtiyaç da vardı3, floresan hücre sıralama aktive, ve akış sitometri3,4. Bu yöntemin avantajları sağlam bir hasat diğer yöntemler üzerinde büyüklük bir sıra artışvardır 5,6, saç köklerinin epitel kısmının dahil, ve hasat hücrelerinin yüksek culturability. 1980’lerde, bu gereksinimleri karşılayacak bilinen bir yöntem yoktu. Sonraki yıllarda, bu yöntem hücre verimini artırmak için rafine edildi. Bu yöntemin temel sınırlama immünorreaktivite tehlikeye bazı tripsin duyarlı antikorların maskeleme olacaktır6.
Fareler özel Patojen Ücretsiz kurallara göre hayvancılık aldı. 1-5 dişi fare 54 ± 2 günlük yaş elde edildi. Yaşlı farelerde, keratinositlerin canlılığı saç döngüsünün anajen faz (büyüme) nedeniyle azalacaktır. Ayrıca, tripsinizasyon süreci genç farelere göre daha zordur. Hasat prosedürü, dişi farelerin erkekle karşılaştırıldığında daha ince derileri için başarıyla optimize edilmiştir. Erkek fareler genellikle keratinosit hasatları için kullanılmaz, çünkü barınma sırasında birbirleriyle savaşma eğilimi vardır ve bu nedenle deride çizikler veya yaralar bırakabilirler.
Protocol
Tüm omurgalı hayvan kullanım protokolleri Önerilen NIH ve hükümet yönergeleri uyarınca Minnesota Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Besleyici Katman Başlatma ve Subculturing Şişeyi 37 °C’lik su banyosuna 1-2 dakika süreyle yerleştirerek sıvı nitrojen tankından 3T3 dondurulmuş İsviçre faresi içeren bir hücreşişesini eritin. Şişedeki hücre sayısı yaklaşık 1 x 106’dır. Son buz parçası eridiğinde 3T3 hücreli şişeyi çıkarın. Tüpü alkol beziyle silin. Sonra şişeyi biyogüvenlik kabinesine aktarın. Hücreleri yavaşça Bir T-150 şişesine aktarın ve 3T3 şişesini 1 mL CGM orta ile durula. Yavaş yavaş hücrelere önceden ısıtılmış 3T3 Komple Büyüme Ortamı (CGM) 30 mL ekleyin. Yavaşça eşit 3T3 fibroblast hücreleri yaymak için şişe kaya. Şişeyi hücre satırı ayrıntıları, tarih ve geçiş numarasıyla uygun şekilde etiketle. Hücreleri %5 CO2 ve nem ile 37 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: ATCC’ye göre, İsviçre faresi 3T3’ün iki katına çıkarma süresi 18 saattir; konfluent (kontak inhibe) zaman, yoğunluğu cm2başına yaklaşık 40.000 hücre . Biz başlatma dan sonra 10-15 pasajlar içinde 3T3 belirli bir çizgi kullanın. Daha hızlı büyüme veya mil şeklindeki hücrelerin varlığı yüksek geçitlerde oluşabilir ve genellikle 3T3 yetişkin fare keratinositler için besleyici hücreler gibi performans olmaz bir işaretidir. Hızlı büyüme oluşursa, alt geçit hücrelerinden yeni bir çizgi başlatmak daha iyidir. Ölü hücreleri ve kalan DMSO ‘yu (kriyoprezervasyon ajanı) ve ondan sonra haftada iki kez kaldırmak için 24 saat sonra ortamı değiştirin. Hücrelerin ‘inin biraraya gelmesine izin verin ve kültür başlatma için T-150 şişelerini kullanın. Başlatmadan sonra alt kültür için T-225 şişelerini kullanın. Altkültür 3T3 fibroblast hücreleri için, hücre kültürü kuluçka dan şişe kaldırmak ve gentamisin ile soğuk steril PBS (1x) ile iki kez yıkayın. Önceden ısıtılmış pipet 10 mL (37 °C su banyosu) tripsin çözeltisi (%0,25) Her T-225 şişesine. Şişeyi 3-8 dk. Bir ısınma plakasına yerleştirin. Şişeyi çıkarın ve hücreleri ayırmak ve ters mikroskop altında hücre ayrışmasını onaylamak için şişenin duvarlarına dokunmak için avuç içlerini hafifçe kullanın. Trypsin çözeltisi müstakil 3T3 hücreleri ile bulutlu görünebilir. Şişenin hücre büyüme yüzeyini yıkamak için tripsin çözeltisini 3-4x pipetlendirin ve 50 mL konik tüpte trypsined hücreyi 30 mL CGM’ye aktarın. 50 mL konik tüpten CGM-tripsin hücrekarışımının 10 mL’si ile şişeyi 3-5x yeniden yıkayın.NOT: 50 mL’lik bir tüpe iki şişe içeriği nin içeriği eklenebilir; sadece bir şişe kullanılırsa, 50 mL’lik bir tüpte 10 mL tripsin/hücreyi 20 mL CGM’ye yerleştirin. 4 °C’de 7 dk için 160 x g’de 50 mL konik boruyu santrifüj edin. Şimdi supernatant aspire ve CGM 5 mL ile hücre pelet resuspend, yavaşça pipetting ~ 10x tamamen hücre pelet bozmak için. 50 mL konik borunun toplam hacmini 15 mL’ye çıkarmak için 10 mL CGM ekleyin. Tekrar ~ 10x karıştırın ve 3 ayrı T-150 şişeiçine hücre süspansiyon 5 mL yerleştirin. Alt kültür oranı T-225 şişelerinde 1:3 veya T-150 şişelerinde 1:4’tur. Şişelerin her birine önceden ısıtılmış 3T3 CGM’den 30 mL ekleyin. Şişeyi hücre satır adı, hücre tohumlama tarihi ve geçiş numarası ile etiketle. Alt kültür adımında santrifüj sonrasında 3T3 hücrelerini dondurmak için 50 mL’lik tüpü santrifüjden çıkarın ve bir buz kovasına yerleştirin. Supernatant aspire ve hasat her şişe için% 5 DMSO-DMEM karışımı 1 mL ile hücre pelet resuspend (Tablo 1bakınız). Her cryovial içine hücre süspansiyonu ile DMSO-DMEM karışımı 1 mL yerleştirin (3T3 flask hasat başına bir cryovial). Şişeyi geçiş numarası, hücre satır adı (3T3) ve hücrelerin dondurulduğu tarihle etiketlendi. Bu 3T3 hücreli şişeleri hücre dondurucu kavanozuna yerleştirin (bkz. MalzemelerTablosu) ve -70 °C dondurucuya >5 h. Şişeleri hücre dondurucu kavanozundan çıkarıp bir sonraki kullanıma kadar uzun süreli depolama için sıvı nitrojen depolama tankına aktarın . Hücre hattı adı, tanktaki konumu ve laboratuvar sıvı azot envanter sayfasına tarih hakkında bilgi girin. 2. X-ışını Işınlama ve Tohumlama için 3T3 Besleyici Tabakasının Hazırlanması 3T3 hücrelerini ışınlamalarından bir hafta önce hazırlayın ve ~0 birleşmelerine izin verin. 3T3 hücreleri genellikle 120 ile 130 arasında olan geçitler içindedir. Primer keratinositlerin başarılı klojen tahlilleri için, 3T3 hücrelerini tohumlamadan önce, yüzey kaplaması 60 mm Petri kaplarını kollajenle kaplar. Alt yüzeyi kaplamak ve fazla kollajen kaplama sıvısını çıkarmak için 60 mm Petri kaplarına kollajen kaplama çözeltisinin yaklaşık 2-3 mL’lik pipet’i (Bkz. Tablo1). Petri yemeklerini en az 1 saat boyunca %5 CO2 ile 37 °C’lik bir kuluçka makinesine aktarın. Kuvözde bulaşıkların kurumasına izin vermeyin. X-ışını ışınlama adımı: 1.4-1.6 adımlarını izleyin. Hücre peletini yeniden askıya almak, konik boruyu kapatmak ve parafin sızdırmazlık filmi ile mühürlemek için 50 mL taze CGM kullanın. Herhangi bir kontaminasyonu önlemek için, tüp ve buz üzerinde yer içeren parafin mühürlü hücre çift çanta için plastik torba kullanın. Bir mitomisin tabanlı alternatif besleyici tabaka keratinosit kültürüiçinkullanılabilir 7 . 50 mL konik tüpteki fibroblast 3T3 hücrelerini biyolojik bir x-ray makinesi ile 5.000 rad (50 Cgy) dozu ile ışınlayın. Bu hücreleri CGM media ile birlikte ışınla. X-ışını ışınlamasonra, 4 °C’de 7 dakika için 160 x g santrifüj hücreleri. Süpernatant ortamı aspire edin ve 5 mL CGM ile hücre peletini yavaşça yeniden askıya alın ~10x.’ı hafifçe üçe katlayın. Şimdi orta ve triturate 10x ek 25 mL ile 30 mL için son hacmi getirmek. Bu üçleme adımları clonojenite tsay için tek tip 3T3 fibroblast tabakası için çok önemlidir. Canlı Hücre sayma: Düzenli cam hemositometre kullanarak keratinositleri sayın. Hücrelerin yaklaşık 0,5 mL’sini alın ve 1,5 mL’lik bir tüpe yerleştirin. Hücre karışımı 200 μL çıkarın ve eşit hacim ekleyin 0.4% Trypan mavi çözelti ve karışım 3-4x. Hücreleri hemositometre ile aktarın ve tüm çekirdekli hücreleri (küçük altın ve pembe hücreler) canlı hücreler olarak sayın. Canlı altın hücrelerin son konsantrasyonu hesaplayın. Pipet 1 x 106 3T3 hücreler (en az 7 x 105) hücre kullanılabilir) içine 60 mm kollajen kaplı Petri kapları (adım 2.2) ve yavaşça modifiye edilmiş yüksek kalsiyum Williams E medya 4 mL ekleyin (Tablo 1bakınız). Taze tohumlu 3T3 hücrelerinin 24 saat boyunca bağlanmasına izin verin. Ertesi gün, taze birincil keratinosit hasat ve aşağıda belirtildiği gibi clonogenic tsay için ekli 3T3 fibroblast tabakasının üstüne tohum. 3. Birincil Keratinosit Hasat ve Tohumlama Onaylanmış hayvan tesisi/IACUC standartlarına göre CO2 inhalasyonu ile dört ila beş yetişkin dişi fareyi ötenazi. Ancak, bu protokol tek dişi/erkek fareler için de kullanılabilir. Bir elektrikli hayvan makası ile dorsal kürk yaklaşık 9 cm2 Klip ve yeterli poviyo iyot antiseptik çözeltisi ile 500 mL kavanoza tüm kırpılmış fareler yerleştirin (fırçalamak değil) 1-2 dakika boyunca onları kapsayacak şekilde. fareler üzerinde çözelti. Çözeltiyi dökün ve sıvı temizolana kadar temiz suyla durulayın. Aynı antiseptik yıkamayı tekrarlayın ve ardından su durulayın. İyot çözeltisi ile antiseptik yıkama sonra, 5-10 dakika boyunca% 70 etanol tüm fareler ıslatın.NOT: Açık kürklü fareler (örneğin, BALB/c) antiseptik iyot yıkarlarından hafif sarımsı bir renk korurken, koyu fareler (örneğin, C57BL/6) tutamaz. Özellikle, hücre canlılığı veya kültür büyüme sarı renk nedeniyle etkilenmez. Dikkatle bir laminar akış kaputunda başparmak forceps ve makas kullanarak kırpılmış sırt derisi çıkarın. Excised dorsal deri konik tüp PBS/2x gentamisin ile dolu yerleştirin. Kültürde meme hücresi kontaminasyonunu önlemek için ventral yan deri kullanmaktan kaçının. Otoklavlı forceps ve neşter kullanarak, ince bir Petri çanak üzerine aşağı bir anda kıllı tarafında bir dorsal deri yerleştirin. Yarı saydam olana kadar deri dokusunun ventral tarafında yağ da dahil olmak üzere tüm deri altı doku kazıma başlayın. Deri (saç folikülü parçası) yırtılma olmadan deri altı doku maksimum izleri kaldırmaya çalışın. Ayrıca, uzun süre kazıyın ve cilt kurumasını önlemek. Kalan tüm ciltler işlenene kadar kazınmış cildi PBS çözeltisinde tutun. Neşter kullanarak derileri 0,5 cm x 1-1,5 cm şeritler halinde dilimleyin ve kıllı tarafı steril bir Petri kabına yerleştirin. Dikkatle pipet 20 mL PBS/2x Gentamicin çözeltisi tripsin (%0.25) ile karıştırılır 100 mm x 20 mm plastik Petri kabına. Steril forsepskullanarak, derileri aktarın ve 32 °C’lik bir kuluçka makinesinde 2 saat boyunca tripsin çözeltisinin yüzeyinde tüylü tarafı yüzdürün.NOT: Tripsinizasyon süresi ve sıcaklık, yüksek oranda ekilebilir primer keratinositlerin verimi için çok önemlidir. Diğer yöntemler canlı hücrelerin iyi verimleri sağlayabilir rağmen, keratinositlerin kültür daha az tatmin edici olmuştur. Bu 2 saat kuluçka süresi boyunca, kollajen kaplama ile kaplama yemekleri ve 37 °C’de 1 saat (bkz. adım 3.1.2). Clonogenic tahliller için, 60 mm Petri kaplar zaten 24 saat önce keratinosit hasat önce ışınlanmış 3T3 besleyici tabakası alt eklemek ve eşit olarak yayMak için izin kaplı olmuştur.NOT: Klojenik kültür için kültür yemeklerinin kapama uygun bağlanması, koloni oluşumu ve fare epidermal keratinositlerin nihai büyümesi/çoğalması için çok önemlidir. Epidermal kazıma adımı: Steril plastik kare Petri kabı nı düzenleyin ve 15 mL hasat ortamıyla uygun epidermal kazıma için 30° eğimde bir yüzey oluşturun (Bkz. Tablo 1). Dikkatle kavisli forseps ile tripsin çözeltisi yüzen bir deri şeridi çıkarın. Yeni bir neşter bıçak ile, epidermis ve orta içine tüyleri kazıyın. Aşırı güç kullanmayın, ancak epidermisin kazınması için yeterli güç kullanın, yoksa hücrenin canlılığını etkiler. Epidermis kazıma sırasında, bıçak deri parçasıdik tutun. Bıçak bıçağın hareketine doğru açılı ise, cilt yırtılma şansı daha fazladır. Bıçak bıçak hareketinden uzağa açılı ise, yetersiz epidermis çıkarma şansı daha fazladır. Dikkatle steril bir 60 mL kavanoz (otoklavable ve yeniden kullanılabilir) içine kazınmış epidermal hücreleri içeren hasat ortamı dökün 1.5 inç manyetik karıştırma çubuğu ile. Kalan epidermal hücreleri toplamak ve son hacmi 30 mL’ye getirmek için Petri kabını ek hasat ortamıyla durulayın. Bir manyetik karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında 20 dakika için 100 rpm karıştırın. Bu işlem kıllardan kapana kısılmış epidermal hücreleri ortadan kaldıracaktır. Steril 70 m hücreli bir süzgeci 50 mL konik tüpün üzerine yerleştirin. Hücre süzgeci 50 mL konik tüpün üstüne sığar. Kavanozu biyogüvenlik başlığının içine götür. Karıştırma çubuğunu çıkarın ve içindekileri 50 mL konik bir tüpe bağlı süzgeç filtresine dökün. İstenmeyen saç ve stratum korneum yaprak dışarı süzün. Süzgeç içinde stratum korneum malzemeleri ile birlikte saç basın ve sıkışmış saç hücrelerini serbest bırakmak için onları işlemek. Kalan kapana kısılmış hücrelerin serbest bırakılması ve tüp içine akmasını sağlamak için 5 mL hasat ortamı kullanın. Konik tüpte toplam hacmi 50 mL’ye kadar getirin. 4 °C’de 7 dk için 160 x g hücre filtrasyon ve santrifüj ile 50 mL konik tüp kaplayın. Sonraki supernatant aspire ve hasat orta 5 mL ekleyin. Hücre peletini 5 mL pipetle hafifçe ~20x’i üçe katlayarak yeniden askıya alın. Bu adımda, herhangi bir toplama önlemek için bir buzlukta hücreleri tutun. 25 mL hasat orta ve triturate tekrar (20-25x) ekleyin. Bu adımda doğru bir keratinosit sayımı sağlamak için, hücre süspansiyon 1 mL almak ve 19 mL hasat orta ekleyin. Hücre seyreltme 50 mL konik tüp 1:20 olduğunu. Keratinositler tek bir fareden hasat edilirse, hücre süspansiyonunun hacmini ayarlayın. 30 mL yerine, 15 mL kullanın ve hücreleri saymak için 1:10 seyreltme yapın. Pipet 50 mL konik tüpten seyreltilmiş hücrelerin 0,5 mL ‘si (1:20 seyreltme) ve 1,5 mL otoklavlı mikrosentrifuge tüpüne aktarın. 0,2 mL (200 μL) hücre karışımını başka bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe çıkarın ve %0,4 Trypan mavi çözeltisi eşit hacim (200 μL) ekleyin. Bu çözeltiyi 3x’i yavaşça karıştırın ve çekirdekli keratinositleri saymak için hücreleri hemositometreye aktarın. Trypan mavisi için tüm koyu mavi hücreleri canlı olmayan ölü hücreler olarak puanlayın ve küçük altın ve pembemsi hücreleri canlı hücreler olarak puanlayın. Fare başına son keratinosit verimi yaklaşık 30 milyon canlı hücre olmalıdır. 4 °C’de 160 x g’de 7 dk için orijinal 50 mL konik tüpü (adım 3.8’den) santrifüj edin. Bu adımda, istenilen ortamda hücreleri resuspend ve tohumlama hücreleri için gerekli seyreltme yapmak. Kitle kültürü için, hücre kültürü orta (KGM tipi orta + monolayer kültürler için takviyeleri) her 35 mm Petri çanak tohum 2 ila 4 milyon canlı altın hücreleri (Tablo 1bakınız). Bir klojen (koloni oluşumu) taht için, x-ışını Üzerinde 60 mm Petri çanak başına 1.000 hücre tohum Kollajen kaplama ile İsviçre fare 3T3 besleyici katmanları ve takviyeleri ve serum ile modifiye William’s E orta. 35 mm ve 60 mm Petri kapları için sırasıyla 2 ila 4 mL orta kullanın. Ayrıca, formüle DMEM ve Williams E orta ATCC’den% 5 CO2kullanmak için sodyum bikarbonat azaltılmış düzeyleri ile temin . Kültür hücrelerini (kütle veya klonojenik) 32 °C’de, nem de %5 CO2ile büyütün. Kitle kültürü için ilk tohumlama bir gün sonra medya değiştirin, ve daha sonra 3x haftalık sonra. Ancak, klonal tahliller için, ilk orta değişim hücre tohumlama sonra 2 gün ve 3x haftalık bundan sonra. Klonal kültür için, iki ve dört haftalık aralıklarla hücreleri yetiştirmek. Klonal kültürlerin tamamlanmasından sonra (2 veya 4 hafta), orta aspire. Kolonileri oda sıcaklığında bir gecede tamponlu formalin ile düzeltin ve otoklav suyunda %0,5 rhodamine B ile 1 saat boyunca lekeleyin. Daha sonra, bulaşıkların kenarından bir pipet ile rhodamine B lekesini çıkarın. Bulaşıklar temizolana kadar bulaşıkları soğuk otoklavlı suyla durulayın. Tabakları tabakların kapağına koyup son koloni sayımı için kurutun. Özellikle, klojenik kültür analizi yaparken, asla pipet <1 mL hücreleri. Hücreler konsantre ise, seri hücre konsantrasyonu seyreltmek.
Representative Results
Tipik olarak, 20 x 106 ila 30 x 106 Trypan mavisi hariç olmak üzere fare başına epidermal keratinosit verimleri8,9elde edilir. Canlılık – arasında değişmektedir. Tipik tohumlama verimliliği 24 h. ışınlanmış 3T3 besleyici katmanlarında Koloni oluşumu yaklaşık% 30 eki c57BL/6 fareler için tohumlu 1.000 canlı hücreler başına yaklaşık 60 koloniler ve İsviçre tipi fareler için 1.000 hücreleri10 ,11. Koloni oluşumu testlerinden elde edilen tipik sonuçlar Şekil1’de gösterilmiştir. Saç folikülü kök hücrelerinin sayısı c57BL/6 fareler için yaklaşık % 9 CD34+/CD49f+ kök hücre12’dir. Akış sitometrisinden tipik sonuçlar Şekil2’de verilmiştir. Dört farklı ortamın büyüme özellikleri Şekil3’te gösterilmiştir. Test edilen medya kgm-altın, SFM, William’s E orta ve Morris-2 (Williams E dayalı Morris laboratuvarında geliştirilen azaltılmış kalsiyum orta) içerir. Şekil 1: Yetişkin farelerden klojenkeratinositler için yapılan bir tneden temsili örnekler. Bu fotoğraf CD-1 dişi farelerden keratinosit kolonisi oluşumunu göstermektedir 54 gün topikal tedavi 1) hiçbir tedavi, 2) aseton bir hafta sonra iki hafta boyunca haftada iki kez aseton tarafından takip, 3) DMBA iki hafta sonra aseton tarafından bir hafta sonra iki kez haftalık izledi iki hafta boyunca, 4) aseton bir hafta sonra TPA tarafından iki hafta boyunca haftada iki kez takip ve 5) DMBA iki hafta boyunca haftada iki kez TPA tarafından takip. In vivo tedavilerinden sonra keratinositler hasat edildi ve her yemek başına 1.000 hücrede, ışınlanmış 3T3’ün besleyici katmanlarına tohumlandı ve iki hafta boyunca kültürlendi, daha sonra yemekler tamponlu formalin ile sabitlendi ve rhodamine B ile boyandı. Her sütundaki yemekler her fare tedavi grubundan kopyalanır. DMBA ile tedavi üzerine daha büyük kolonilerin sayısının arttığını ve toplam koloni sayısının keratinosit hasattan önce farelerin TPA tedavisini artırdığını unutmayın. Kısaltmalar: DMBA: 7,12-dimethylbenz[a]anthracene; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-asetat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Yetişkin farelerden saç folikülü kök hücrelerinin akış sitometrisinin temsili örneği. Kısaca, izole primer keratinositler dorsal farelerin derisinden izole edildi ve hücre filtresi kullanılarak hücresel enkaz için filtrelendi. İzole keratinosit süspansiyonu CD49f veya α6-integrin (PE) ve CD34 (FITC) antikorları ile canlı ölü boya ve diğer kontrollerle etiketlendi. FITC ve PE isotip kontrol antikorları (Rat IgG2akappa) tazminat amacıyla kullanılmıştır (bkz. Kök hücreler, bazal epidermal ve saç folikülü hücrelerinde bulunan hemi-desmozomların dış bileşenini tanıyan CD49f (PE kanalı) ve saç folikülü kök hücrelerini (cd34-FITC+ ve a6-PE+ (sağ üst kolon, toplam %5). Sağ kolon farklı keratinosit popülasyonları yani CD34-FITC sadece, CD34-FITC ve a6-PE hücreleri (çift pozitif kök hücre popülasyonu), a6-PE sadece gösterir ve lekesiz hücreler. 6 ,14olarakbildirilmiştiriki CD34+ kök hücre popülasyonları olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Erişkin dişi farelerden epidermal hücrelerin birincil kültürleri üzerinde dört farklı ortam karşılaştırılması. Primer keratinositler dorsal farelerin derisinden izole edildi ve dört farklı ortam (KGM, SFM, Willem’s-E ve Morris-2) kullanılarak tohumlama için sayıldı. Keratinositlerin eşit sayıda tohumlanmış ve genel morfoloji ve büyüme deseni için takip edildi. Çoğalan keratinositlerin biraz farklı morfolojileri olduğunu unutmayın. KGM, SFM ve Morris-2 bunların hepsi azaltılmış kalsiyum medya on dört gün sonra en sağlam büyüme var. Buna karşılık, hücreler 1.4 mM kalsiyum ve sodyum potasyum oranı yüksek olan Williams E ortamda kültürlü zaman devam etmez. Şaşırtıcı, Williams E orta takviyeleri ve yüzde yirmi fetal sığır serum keratinosit klonal kültürleri çok daha iyi başka bir orta test destekler, muhtemelen zenginleştirilmiş Williams E orta 3T3 besleyici hücreleri “beslemek” için yardımcı olur çünkü daha iyi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Çözümler ve Medya Yorum Hasat Çözümleri %2.5 tripsin (5 mL) Dulbecco’nun PBS’si (500 mL) Gentamisin (2 mL) 2x gentamisin (45 mL) ile PBS Fosfat tamponlu salin (PBS) 2x gentamisin ile Tripsin çözeltisi Hücre Kültürü Çözümleri Purecol-fibronectin çanak kaplama çözeltisi: 1 M HEPES (1 mL) 116 mM CaCl2 (1 mL) Sığır serum albumini 1.0 mg/mL (10 mL) Hücre kültürü ortamı (100 mL) Fibronektin (1 mg) Purecol kollajen (1 mL) Hücre dondurma çözeltisi DMSO (2 mL) BCS ve kalem strep ile DMEM Hasat Orta Kalsiyumsuz olması gerekiyor 2x gentamisin (1 mL) FBS (50 mL) Kobİ (500 mL) Yüksek Kalsiyum Williams ‘E Medya ile: EGF (5 g/mL) 1 mL Glutamin 14.5 mL Hidrokortizon (1 mg/mL) 0.5 mL İnsülin 1 mL LinoAsit-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 mL MEM Ess AminoAsitler 4 mL MEM Vitaminler 5 mL Penisilin-Streptomisin 5 mL Transferrin (5mg/mL) 1 mL Vit A (1 mg/1.000 μL) 57.5 μL Vit E 1 mg/mL (4°C) 3.5 μL Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL 3T3 fibroblast komple büyüme ortamı (CGM) BCS (100 mL) DMEM (900 mL) Penisilin-streptomisin (10 mL) KGM Kitle kültürü için kullanılan ortam azalmış kalsiyum orta Morris 2 Williams ‘E aynı takviyeleri ile orta Takviyeleri ile Williams E azaltılmış kalsiyum varyantı Tablo 1: Çözüm ve medya tarifleri.
Discussion
Burada açıklanan keratinosit hasat yöntemi yetişkin dişi farelerin arkasından yüksek küllü primer epidermal keratinositler üretmek için geliştirilmiştir. Bu keratinositler akış sitometrisi, moleküler biyoloji uygulaması ve kloojenik tsay da dahil olmak üzere birincil hücre kültürü için uygundur. Bu keratinosit hasat yöntemi de kutanöz kimyasal karsinogenez ve tümör promosyondiğerdownstream yönlerini incelemek için yararlı olmuştur1 ,13.
Protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, sertlik ve tekrarlanabilirlik için 54 ± 2 gün yaş kadın fareler kullanıldı. Bu bize farelerin birden fazla suşları hassas ve kantitatif koloni tahlilleri gerçekleştirmek ve bağlantı analizinde en az bir yeni kök hücre düzenleyici gen10,11belirlenmesine yol açan bir fenotip olarak kullanmak için sağladı. İkinci olarak, tripsinizasyon cildi bütün tutmaya çalışırken daha etkili olduğu gibi, daha küçük parçalar halinde derileri kesmek için yararlıdır. Üçüncü olarak, tripsin yüzdürme zamanı ve sıcaklığı sonraki suçluluk için çok önemlidir. Ayrıca, bir ekli hücreleri yerinden etmek için filtre üzerinde kalan kılları “önemli ölçüde dürtmek” gerekir. Bu adım hücrelerin yüksek verim elde etmek için önemlidir. Ayrıca, kuvöz32 °C sıcaklık yetişkin farelerkeratinositlerin uzun vadeli ekimi için önemlidir. Son olarak, bu protokolde, in vitro ve in vivo deneyler1 paralel okumalar alt kültürler veya hücre hatları yerine birincil kültürlere dayanmaktadır. Özellikle, bu protokolü kullanarak ilk kez birincil keratinosithas eğer, histopatolojik gözlem ile epidermis ile birlikte saç köklerinin tam kaldırılmasını onaylamak için kazıma sonra kalan dermis tutun.
Yetişkin fare keratinosithas için bu protokolün temel gücü birçok downstream uygulamaları için uygun culturable hücrelerin yüksek verimleri üretir olmasıdır. Başlıca sınırlama bazı hücre yüzeyi epitopsinizasyon immünostaining tehlikeye olabilir gibi hassas olabilir. Bu nedenle, yeni bir hücre yüzeyi antikor test ederken, karşılaştırma için hasat için bir dispase6 veya termolizin5 tabanlı yöntem kullanmak ihtiyatlı olabilir. Bu protokolün önemi, kitle kültürleri için clonogenic kök hücreler1,9,10,11, için tahliller gibi çeşitli uygulamalara titizlikle test edilmiş, sayısallaştırılmış ve çeşitli uygulamalara uygulanmış olmasıdır. biyokimya8, kök hücre analizinde FACS sıralama için3,4, moleküler biyoloji için3,12, ve devam eden RNA ve DNA dizileme için.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarların hiçbir takdiri yok.
Materials
| 0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. . Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
Cite This Article
Morris, R. J., Readio, N., Boland, K., Johnson, K., Lad, S., Singh, A., Singh, A., Holtorf, S., Skaar, S. Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture. J. Vis. Exp. (150), e58701, doi:10.3791/58701 (2019).