Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Alle protocollen voor het gebruik van gewervelde dieren zijn goedgekeurd door de Universiteit van Minnesota institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité in overeenstemming met aanbevolen NIH en overheidsrichtlijnen. 1. initialisatie van de feederlaag en Subculturing Ontdooi één celflacon met bevroren Zwitserse muis 3T3 uit de vloeibare stikstof tank door de injectieflacon in een waterbad van 37 °C te plaatsen voor 1-2 min. Het aantal cellen in de injectieflacon is ongeveer 1 x 106. Verwijder de 3T3 celflacon wanneer de laatste strook ijs gesmolten is. Veeg de tube schoon met een 70% alcoholdoekje. Breng vervolgens de injectieflacon over naar een bioveiligheidskast. Breng de cellen langzaam over in een T-150 kolf en spoel de 3T3-injectieflacon af met 1 mL CGM-medium. Voeg langzaam 30 mL pre-warmed 3T3 complete Growth medium (CGM) toe aan de cellen. Draai de kolf zachtjes om de 3T3 fibroblast cellen gelijkmatig te verdelen. Label de kolf met de details van de cellijn, de datum en het passage nummer op de juiste manier. Inincuberen de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid.Opmerking: Volgens de ATCC is de verdubbelingstijd van de Zwitserse muis 3T3 18 uur; Wanneer Confluent Health (contact geremd), de dichtheid is ongeveer 40.000 cellen per cm2. We gebruiken een bepaalde lijn van 3T3 binnen 10-15 passages na initialisatie. Een snellere groei of de aanwezigheid van spindel vormige cellen kan bij hogere passages voorkomen en is meestal een teken dat de 3T3 niet zo goed zal presteren als feedercellen voor volwassen muis keratinocyten. Als een snelle groei optreedt, is het beter om een nieuwe lijn te initiëren vanuit de onderste passage cellen. Verander media na 24 h om dode cellen te verwijderen en de resterende DMSO (cryopreservation agent), en twee keer per week daarna. Laat cellen vermenigvuldigen rond 80% samenloop en gebruik T-150 kolven voor cultuur initiatie. Gebruik T-225 kolven voor subcultuur na initialisatie. Voor de subcultuur van 3T3 fibroblast cellen, verwijder de kolf uit de celkweek incubator en was tweemaal met koude steriele PBS (1x) met gentamycine. Pipet 10 mL voorverwarmde (37 °C waterbad) trypsine oplossing (0,25%) in elke T-225 kolf. Plaats de kolf op een verwarmende plaat voor 3-8 min. Verwijder de kolf en gebruik voorzichtig palmen om de wanden van de kolf te tikken om cellen los te maken en cel loslating onder omgekeerde Microscoop te bevestigen. Trypsine-oplossing kan troebel lijken met vrijstaande 3T3-cellen. Pipet de trypsine-oplossing 3 – 4x om het celgroei oppervlak van de kolf te wassen en breng de trypsinized Cell over naar 30 mL CGM in een conische buis van 50 mL. Rewash de kolf 3 – 5x met 10 mL van het CGM-trypsine-celmengsel uit de conische buis van 50 mL.Opmerking: De inhoud van twee kolf inhoud kan worden toegevoegd aan een buis van 50 mL; Als slechts één kolf wordt gebruikt, plaats dan 10 mL trypsine/cellen in 20 mL CGM in een tube van 50 mL. Centrifugeer de conische buis van 50 mL bij 160 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Zuig nu de supernatant op en hervat de celpellet met 5 mL CGM, Pipetteer zachtjes ~ 10x om de celpellet volledig te verstoren. Voeg 10 mL CGM toe om het totale volume van de conische buis van 50 mL te brengen tot 15 mL. Meng opnieuw ~ 10x en plaats 5 mL van de celsuspensie in 3 afzonderlijke T-150 kolven. De subcultuurverhouding is 1:3 in T-225 kolven of 1:4 in T-150 kolven. Voeg 30 mL voorverwarmde 3T3 CGM toe aan elk van de kolven. Label de kolf met de naam van de cellijn, de datum van de celseeding en het passage nummer. Om 3T3 cellen na centrifugeren in de subcultuurstap te bevriezen, verwijdert u de 50 mL buis uit de centrifuge en plaats deze op een ijsemmer. Zuig het supernatant op en hervat de celpellet met 1 mL van 5% DMSO-DMEM-mengsel (Zie tabel 1) voor elke geoogste kolf. Plaats 1 mL DMSO-DMEM mengsel met celsuspensie in elke cryoflacon (één cryovial per 3T3-kolf geoogst). Label de injectieflacon met het passage nummer, de naam van de cellijn (3T3) en de datum waarop de cellen zijn bevroren. Plaats deze 3T3 cel flesjes in de cel vriezer jar (Zie tabel van de materialen) en transfer naar-70 °c vriezer voor > 5 h. voorzichtig Verwijder en breng de flesjes van de cel vriezer jar en plaats in een vloeibare stikstof opslagtank voor lange termijn opslag tot het volgende gebruik . Voer informatie in over de naam van de cellijn, de locatie in de tank en de datum in het inventaris blad van vloeibaar stikstof laboratorium. 2. bereiding van de 3T3 feeder Layer voor röntgenstraling en seeding Bereid 3T3 cellen een week voor hun bestraling en laat ze groeien ~ 100% samenvloeiing. De 3T3 cellen zijn meestal binnen de passages van 120 aan 130. Voor succesvolle clonogene assays van primaire keratinocyten, voor het zaaien van 3T3 cellen, oppervlaktecoating de 60 mm Petri schaaltjes met een collageen. Pipet teer ongeveer 2 – 3 mL van de collageen-coating oplossing in 60 mm Petri schalen om het bodemoppervlak te omhulen en verwijder de overtollige collageen coating vloeistof (Zie tabel 1). Breng de Petri schaaltjes over naar een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor minimaal 1 uur. Laat de gerechten niet drogen in de incubator. Röntgenstraling stap: Volg de stappen 1.4 – 1.6. Gebruik 50 mL verse CGM om de celpellet opnieuw op te schorten, de conische buis en afdichting te sluiten met paraffineafdichtingfilm. Om besmetting te voorkomen, gebruikt u plastic zakken om de met paraffine verzegelde cel met buis en plaats op ijs te verdubbelen. Een mitomycine gebaseerde alternatieve feeder Layer kan worden gebruikt voor in Culture7. Bestraalde fibroblast 3T3 cellen in de conische buis van 50 mL met een 5.000 rads (50 Cgy) dosis met een biologische Röntgen machine. Bestraleren deze cellen samen met de CGM-media. Na röntgenstraling, centrifugeer cellen bij 160 X g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Aspireren de supernatant media en voorzichtig regende celpellet met 5 mL CGM triturating zachtjes ~ 10x. Breng nu het uiteindelijke volume naar 30 ml met extra 25 ml medium en wrijf 10x. Deze triturerende stappen zijn cruciaal voor uniforme 3T3 fibroblast laag voor clonogenicity assay. Levensvatbare Celtelling: Tel de keratinocyten met behulp van een gewone glas hemocytometer. Neem ongeveer 0,5 mL van de cellen en plaats in een buis van 1,5 mL. Verwijder 200 μL celmengsel en voeg een gelijk volume van 0,4% Trypaan blauwe oplossing en mengsel 3 – 4x toe. Cellen overbrengen met een hemocytometer en tellen alle nucleated cellen (kleine goud en roze cellen) als levensvatbare cellen. Bereken de uiteindelijke concentratie van levensvatbare goud cellen. Pipetteer 1 x 106 3T3 cellen (een minimum van 7 x 105) cellen mogen worden gebruikt) in 60 mm met collageen beklede Petri schalen (stap 2,2) en voeg voorzichtig 4 ml gemodificeerde High-calcium Williams E-media toe (Zie tabel 1). Laat vers geplaatste 3T3-cellen voor 24 uur bevestigen. Op de volgende dag, oogst de verse primaire in en zaai ze bovenop de bijgevoegde 3T3 fibroblast laag voor clonogene assay zoals hieronder aangegeven. 3. primaire Keratinocyte oogsten en zaaien Euthanitering van vier tot vijf volwassen vrouwelijke muizen via CO2 inademing volgens erkende dieren faciliteit/IACUC normen. Dit protocol kan echter ook worden gebruikt voor alleenstaande vrouwelijke/mannelijke muizen. Klem ongeveer 9 cm2 van de rugvacht met een elektrische dieren klipper en plaats alle geknipte muizen in een pot van 500 ml met voldoende Povidon jodium antiseptische oplossing (niet schrobben) om ze te bedekken voor 1 – 2 min. schud de pot goed om de antiseptische laag gelijkmatig te oplossing over de muizen. Giet de oplossing af en spoel met schoon water totdat de vloeistof helder loopt. Herhaal dezelfde antiseptische wassing gevolgd door een waterspoeling. Na de antiseptische wassen met jodiumoplossing, weken alle muizen in 70% ethanol voor 5 – 10 min.Opmerking: Muizen met een lichte vacht (bijv. BALB/c) behouden een lichte geelachtige kleur van de antiseptische jodium wassen, terwijl donkerdere muizen (bijv. C57BL/6) dat niet zullen doen. Met name, cel levensvatbaarheid of cultuur groei wordt niet beïnvloed als gevolg van de gele kleur. Verwijder voorzichtig de geknipte rughuid met behulp van een duim Tang en een schaar in een laminaire stroom afzuigkap. Plaats de bekrachtigd rughuid in conische buis gevuld met PBS/2x gentamycine. Vermijd het gebruik van de ventrale kant huid om de besmetting van de borst cellen in de cultuur te voorkomen. Met behulp van geautoclaveerd Tang en een scalpel, plaats een rughuid in een tijd harige kant naar beneden op een dun Petri schaaltje. Begin met het schrapen van alle subcutane weefsels, inclusief vet van de ventrale zijde van het huid weefsel, totdat het halfdoorzichtig is. Probeer maximale sporen van subcutaan weefsel te verwijderen zonder de huid te scheuren (haarfollikel deel). Ook, niet Schaaf voor een lange tijd en Vermijd het drogen van de huid. Houd de huid van de geschraapt in PBS-oplossing totdat alle overige skins zijn verwerkt. Gebruik een scalpel om skins in 0,5 cm x 1 – 1.5 cm strips te snijden en de harige kant op een steriel Petri schaaltje te plaatsen. Pipetteer voorzichtig 20 mL PBS/2x Gentamicin-oplossing vermengd met trypsine (0,25%) in een plastic Petri schaaltje van 100 mm x 20 mm. Gebruik steriele Tang, breng de skins over en drijf ze met de harige kant naar boven op het oppervlak van trypsine-oplossing voor 2 uur in een incubator van 32 °C.Opmerking: trypsinisatie tijd en temperatuur zijn cruciaal voor een goede opbrengst van zeer culturable primaire keratinocyten. Hoewel andere methoden goede opbrengsten van levensvatbare cellen kunnen bieden, is de culturabiliteit van de keratinocyten minder bevredigend. Tijdens deze incubatietijd van 2 uur worden de gerechten met collageen coating en op 37 °C gedurende 1 uur (zie stap 3.1.2) aangebracht. Voor clonogene assays zijn de 60 mm Petri schalen al 24 uur gecoat voorafgaand aan het oogsten van in, zodat de bestraalde 3T3 feederlaag aan de onderkant wordt bevestigd en gelijkmatig wordt verdeeld.Opmerking: Coating van cultuur gerechten voor clonogene cultuur is zeer belangrijk voor de juiste hechting, kolonie vorming, en de uiteindelijke groei/proliferatie van muizen epidermale keratinocyten. Epidermale schrapings stap: regel een steriele plastic vierkante Petri schaal en creëer een oppervlak op een helling van 30 ° voor een goede epidermale schrapen met 15 mL oogst medium (zie tabel 1). Verwijder voorzichtig een zwevende huid strook uit de trypsine-oplossing met gebogen Tang. Met een nieuw scalpel blad schrait u de epidermis en haren in het medium. Gebruik geen overmatige kracht, maar gebruik voldoende kracht om de epidermis te schraken, of het zal de levensvatbaarheid van de cel beïnvloeden. Houd tijdens het schrapen van de epidermis het blad loodrecht op het huid stuk. Als het mes naar de beweging van het blad wordt gekanteld, is er meer kans op scheuren in de huid. Als het blad is schuin verwijderd van de blade beweging, er zijn meer kans op onvoldoende epidermis verwijdering. Giet voorzichtig het oogst medium met geschuurd epidermale cellen in een steriele 60 mL pot (autoclaveerbaar en herbruikbaar) met een 1,5 inch magnetische roerstaaf. Spoel de Petri schaal met extra oogst medium om overgebleven epidermale cellen te verzamelen en breng het uiteindelijke volume naar 30 mL. Gebruik een magnetische roerder en roer 100 rpm gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Dit proces zal de gevangen epidermale cellen van haren verwijderen. Plaats een steriele 70 μm celzeef op de bovenkant van een conische buis van 50 mL. De celzeef past bovenop een conische buis van 50 mL. Neem de pot in een bioveiligheid Hood. Verwijder de roer stang en giet de inhoud in zeef filter bevestigd aan een conische buis van 50 mL. Ongewenst haar en vellen stratum corneum uitbelasten. Druk de haren samen met stratum corneum materialen in de zeef en manipuleer ze om de ingesloten haarcellen vrij te geven. Gebruik 5 mL oogst medium om overgebleven gevangen cellen vrij te maken en in de buis te laten stromen. Breng het totale volume tot 50 mL in conische buis. Dop de conische buis van 50 mL met celfiltraat en centrifugeer bij 160 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Volgende aspiraat de supernatant en voeg 5 ml van het oogst medium. Rebreng de celpellet door zachtjes te tritureren ~ 20x met een pipet van 5 mL. Houd de cellen in een koelbox bij deze stap om aggregatie te voorkomen. Voeg 25 ml oogst medium toe en wrijf opnieuw (20 – 25x). Om te zorgen voor een nauwkeurige in telling bij deze stap, neem 1 ml celsuspensie en voeg 19 ml oogst medium. Nu is de celverdunning 1:20 in 50 mL conische buis. Als keratinocyten uit één muis worden geoogst, past u het volume van de celsuspensie aan. Gebruik in plaats van 30 mL 15 mL en maak een 1:10 verdunning voor het tellen van de cellen. Pipet 0,5 mL verdunde cellen uit de conische buis van 50 mL (1:20 verdunning) en breng deze over in een geautoclaveerd micro centrifugebuis van 1,5 mL. Verwijder 0,2 mL (200 μL) celmix tot een andere micro centrifugebuis van 1,5 mL en voeg een gelijk volume (200 μL) van 0,4% Trypeen blauwe oplossing toe. Meng deze oplossing 3x zachtjes en breng cellen over naar een hemocytometer voor het tellen van nucleated keratinocyten. Scoor alle donker blauwe cellen positief voor Trypan Blue als niet-levensvatbare dode cellen, en scoor kleine goud-en roze cellen als levensvatbare cellen. De uiteindelijke opbrengst in per muis moet ongeveer 30.000.000 levensvatbare cellen. Centrifugeer de oorspronkelijke conische buis van 50 mL (vanaf stap 3,8) gedurende 7 minuten bij 160 x g bij 4 °c. Bij deze stap, respendeer de cellen in het gewenste medium en maak de vereiste verdunning voor zaaien cellen. Voor massacultuur, zaad 2 tot 4.000.000 levensvatbare gouden cellen in elke 35 mm Petri schaal in celkweekmedium (kgm-type medium + supplementen voor monolaag culturen) (Zie tabel 1). Voor een clonogene (kolonie vorming) Assay, zaad 1.000 cellen per 60 mm Petri schaal op X-Ray bestraalde Zwitserse muis 3T3 feeder lagen met collageen-coating en gemodificeerde William’s E medium met supplementen en serum. Gebruik in totaal 2 tot 4 mL medium voor respectievelijk 35 mm en 60 mm Petri schalen. Ook formuleren DMEM en Williams E medium verkregen uit ATCC met verlaagde niveaus van natriumbicarbonaat voor gebruik bij 5% CO2. Kweek de kweekcellen (massa of clonogeen) bij 32 °C, 95% vochtigheid met 5% CO2. Verander de media één dag na de eerste zaaien voor de massacultuur en daarna 3x per week. Echter, voor van klonen assays, de eerste gemiddelde verandering is 2 dagen na het zaaien van de cel en 3x per week daarna. Voor de klonale cultuur cultiveer je de cellen met intervallen van twee en vier weken. Na voltooiing van de klonale culturen (2 of 4 weken), aspireren het medium. Bevestig de kolonies in 10% gebufferde formaline ‘s nachts bij kamertemperatuur en beits met 0,5% Rhodamine B in autoclaaf water gedurende 1 uur. Verwijder vervolgens de Rhodamine B vlek met een pipet van de rand van de gerechten. Spoel de gerechten af in koud geautoclaveerd water tot de gerechten duidelijk worden. Zet de gerechten schuin op het deksel van de gerechten en laat ze drogen voor de uiteindelijke kolonie telling. Met name, bij het uitvoeren van clonogene kweek test, pipetteren nooit < 1 mL cellen. Als de cellen geconcentreerd zijn, Verdun de celconcentratie sereen.