Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) transformou-se estudos de transcriptomic. Enquanto em grande escala RNAseq de célula única pode ser executada usando uma variedade de técnicas, como as gotas^1,2, Microfluido³, nanogrids⁴e micropoços⁵, a maioria dos métodos não pode classificar tipos de células definidas que expressam fluorophores geneticamente codificado. Para isolar uma população selecione a célula, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é frequentemente usada para classificar as pilhas etiquetadas em um modo de célula única. No entanto, FACS tem algumas restrições e requer etapas de processamento de amostra meticuloso. Em primeiro lugar, um grande número de células de entrada é normalmente necessários (muitas vezes vários milhões de células / mL), com uma fração significativa (> 15 – 20%) contendo a população rotulada. Em segundo lugar, preparações da pilha podem exigir várias rodadas de etapas de centrifugação gradiente de densidade para remover fração glia, detritos e aglomerados de células que caso contrário podem obstruir o bocal ou fluxo de célula. Em terceiro lugar, FACS geralmente emprega a coloração e descoloração passos para viver/morrer coloração (por exemplo, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), iodeto de propidium (PI) e corantes Cytotracker), que ocupam tempo adicional. Em quarto lugar, como uma regra de ouro para duas cores classificação (como DAPI e proteína fluorescente verde/vermelho (GFP/RFP)), geralmente duas amostras e um controle são necessários, exigindo uma amostra sem rótulo para ser processado além da estirpe do mouse desejado. Em quinto lugar, a filtragem é frequentemente realizada várias vezes antes e durante a amostra classificação para proativamente evitar linhas de exemplo obstruído em uma máquina de FACS. Em sexto lugar, o tempo deve ser atribuído em configurações de FACS mais comumente usadas para inicializar e estabilizar o fluxo de fluido e realizar a calibração da gota. Sétimo, controle de amostras geralmente são executadas em sequência antes da colheita de amostra real para criar matrizes de compensação, rejeição de gibão, definindo portões, etc. os usuários também executar as etapas 6 e 7 se antes do tempo ou exigir o assistência de um técnico em paralelo. Finalmente, post-FACS, muitas vezes há medidas para assegurar que somente rotulado única células estão presentes em cada poço; por exemplo, verificando as amostras em uma configuração de alto teor de triagem como um gerador de imagens de prato rápido.

Para contornar as etapas descritas acima e facilitar um relativamente rápida, alvo de sequenciamento de uma pequena população de neurônios fluorescente etiquetadas único, descrevemos um manual de classificação procedimento seguido por duas rodadas de um altamente sensíveis em vitro Protocolo de amplificação, chamado dobro da transcrição in vitro com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq). A geração de biblioteca de amplificação e do cDNA de RNA é adaptada de Eberwine et al . ⁶ e Hashimshony et al . ⁷, com certas modificações para atender interneurônios rato que têm volumes menores de celulares; Além disso, encontramos também é igualmente útil para excitatórios neurônios piramidais.