Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan
Summary
Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.
Abstract
Erythroid hücre bağlılık ve farklılaşma etkinleştirmesi belirleme ve faktörler olgunlaşması hücre kaderi bir grup tarafından düzenledi lineage tarafından kısıtlanmış transkripsiyon ağ üzerinden devam etmek. Biz daha önce faktörler doğrudan lineage fibroblastlar indüklenen erythroid ataları/öncüleri (iEPs) yeniden programlama kullanarak kırmızı kan hücresi geliştirme talimat için gerekli en az sayıda tanımlamak için yola çıktı. Biz bu overexpression Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc (GTLM) hızlı bir şekilde dönüştürmek fare ve insan fibroblast doğrudan bona fide erythroid hücre morfolojisi, açısından benzer iEPs için olabilir gösterdi fenotip, ve gen ekspresyonu. Biz iEPs arttığından ve hücre kader düzenleme eğitim için paha biçilmez bir araç sağlamak niyetindeyim. Burada fare kuyruk ucu fibroblastlar (DLR) yeniden programlama iEPs üzerinden transkripsiyon faktörü uygulamalı doğrudan lineage dönüştürme kademeli işlemi açıklanmaktadır. Bu örnekte, biz fibroblastlar gelen sarı floresan protein (YFP) erythroid hücre görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör gen (EpoR) düzenleyici kontrolü altında hızlı erythroid soy izleme fareler içinde yeniden programlama yapmak yeniden programlama üzerine kader indüksiyon. Bu iletişim kuralı fibroblastlar beş-sekiz gün içinde iEPs programlanabilir.
Gelişmeler hala süreci için yapılabilir iken, biz GTLM-aracılı yeniden programlama hızlı ve doğrudan bir süreç, bona fide özelliklerini içeren hücreleri erythroid yaratıcı ve öncü hücreleri verimli gösteriyor ki.
Introduction
Kırmızı kan hücreleri (RBCs) tüm omurgalıların gereklidir ve tüm hücreleri insan organları%184’yapmak. Yetişkin yaşam için gelen embriyonik, sağlığımız çok RBC homeostazı tam regülasyonu bağlıdır. Olgun RBCs geliştirme yetişkinlik boyunca devam eden üretim arttığından bilinir. RBC geliştirme ve ilkel ve kesin arttığından arasında geçiş alacak ana düzenleyiciler tanımlamak için arttığından araştırma büyük bir sorun olduğunu. Doğrudan soy erythroid ataları yeniden şekillendirmek için daha erythroid geliştirme içinde vivoanlamak için bir fırsat sunuyor.
Doğrudan soy da transdifferentiation bilinen (DLR), yeniden programlama pluripotent ve multipotent progenitör aşamaları atlayarak bir hücre tipi doğrudan içine başka yeniden programlama işlemidir. DLR, sinirsel2, hematopoetik3,4,5, hepatik6 ve nefrotik7, progenitör hücre de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri üretmek için şu ana kadar kullanılmıştır. Gelişimsel biyologlar için DLR lineage bağlılık ve terminal farklılaşma işlemler8,9sorgulama yönleri için önemli bir araç haline gelmiştir. DLR tamamlayan ve kısmen in vivo çalışmalar anlayış mekanizmaları hücre kader geliştirme sırasında faktörlerin belirlenmesi için değiştirin. Bu raporda açıklanan erythroid ataları yeniden programlama için DLR protokol alanı arttığından gelişim çalışmaları için ücretsiz bir yöntem sağlar.
Daha önce dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast doğrudan bağlı erythroid ataları için yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermiştir (iEPs) 10. erythroid GTLM yeniden programlanan hücreler büyük ölçüde bona fide ilkel erythroid ataları morfoloji, fenotip ve gen ifade10açısından benzer. Böylece iEPs nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesi sınırlı ve çekirdekli eritrositler geçici kesin arttığından başlangıcından önce erken embriyo üretilen benzer olgun. (Örneğin, nokta faktörler veya diğer faktörlerin yanı sıra yeniden programlama içinde mutasyonlar) programlama koşullarında değişiklikler yaparak, biri nasıl bu erythroid geliştirme ve farklılaşma değişikliklere neden anlayabiliyorum. Biz örneğin Klf1 veya Myb eklenmesi için GTLM kokteyl globin ifade deseninin ağırlıklı olarak embriyonik (ilkel) değişiklikleri için esas olarak yetişkin göstermiştir (kesin). Bu bulgu DLR arttığından gelişimsel faktörleri tanımlamak için bir araç olarak kullanarak geçerlilik doğruluyor.
Burada, iEPs fare kuyruk ucu fibroblastlar (TTF) oluşturma işlemine anahat. Temsilcisi sonuçlarımızda fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor– Cre R26– eYFP) Rosa26 odağı tüm gelen sarı floresan protein (eYFP) ifade bu hücreleri erythroid soy bağlılık kolay görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör ifade ettiler. Bu yöntemi kullanarak, YFP pozitif (EpoR +) hücrelerinin beş gün sonra iletim gibi erken mevcut. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, erythroid ataları vitroüretimi için hızlı ve sağlam bir teknik sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast iEPs10için doğrudan yeniden programlamak için yeterli. Programlanmış erythroid hücreleri bona fide erythroid ataları morfoloji, fenotip, gen ekspresyonu ve koloni kurma yeteneği açısından büyük ölçüde andıran. Bu bulgu gelişimsel faktörler hematopoiesis içinde tanımla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Evelyn Wang ve Gregory Hyde (Whitehead Enstitüsü, Cambridge, MA) klonlama ve Harvey Lodish (Whitehead Enstitüsü) için birçok retroviral kütüphane oluşturmak için kullanılan plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz berkay Siva ve Sofie Singbrant (Moleküler Tıp bölümü ve gen terapisi, Lund Üniversitesi), Göran Karlsson ve Shamit Soneji (moleküler Hematoloji Bölümü, Lund Üniversitesi) Açıklama IEP üretim rolleri için teşekkür ederim. Ayrıca kabul ve teşekkür Julian Pulecio (rejeneratif tıp merkezi, Barcelona Biyomedikal Araştırma Parkı), Violeta Rayonu-Estrada (The Rockefeller Üniversitesi, New York), Carl Walkley istiyorum (St. Vincent’ın Enstitüsü tıbbi araştırma ve Bölümü tıp, St Vincent’ın hastane, Melbourne Üniversitesi), Ángel Raya (Katalan kurumun araştırma ve ileri araştırmalar, Barcelona) ve Vijay G. Sankaran (Broad Enstitüsü Massachusetts Institute of Technology ve Harvard, Cambridge ) Bu çalışmaya önceki katkılarından dolayı. Bu eser (için JF); Ragnar Söderberg Vakfı tarafından desteklenmiştir İsveç Araştırma Konseyi (için JF); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (için JF); İsveçli Vakfın Stratejik Araştırma (için JF); Åke Wiberg’ın kuruluşuna (J.F.); Marie Curie tümleştirme grant (için JF).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
