Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide
Summary
Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).
Abstract
Diferenciação e compromisso de célula eritroide proceder através da ativação de uma rede de linhagem restrita transcriptional orquestrada por um grupo de destino célula determinando e fatores de maturação. Estabelecemos anteriormente para definir um conjunto mínimo de factores necessários para instruir o desenvolvimento de células vermelhas do sangue, usando a linhagem direta reprogramação de fibroblastos em eritroide induzido progenitores/precursores (iEPs). Nós mostramos a superexpressão de Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) podem rapidamente converter murino e humano fibroblastos diretamente para iEPs que se assemelham a bona fide eritroide de células em termos de morfologia, fenótipo, e expressão gênica. Pretendemos que iEPs irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar o Regulamento de eritropoiese e célula de destino. Aqui descrevemos o processo gradual de conversão de fibroblastos de ponta de cauda murino em iEPs através da transcrição orientada por fator linhagem direta reprogramação (DLR). Neste exemplo, podemos realizar a reprogramação de fibroblastos de camundongos de linhagem traçagem eritroide que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) sob o controle do promotor eritropoietina receptor gene (EpoR), permitindo a visualização da célula eritroide indução de destino após reprogramação. Na sequência deste protocolo, os fibroblastos podem ser reprogramados em iEPs dentro de cinco a oito dias.
Enquanto melhorias ainda podem ser feitas para o processo, nós mostramos que mediada por GTLM reprogramação é um processo rápido e directo, produzindo células com propriedades de bona fide células progenitoras e precursor de eritroide.
Introduction
Glóbulos vermelhos (hemácias) são essenciais em todos os vertebrados e somam 84% de todas as células do corpo humano1. De embrionário para a vida adulta, nossa saúde é altamente dependente de regulação exata da homeostase de RBC. A produção contínua de hemácias maduras durante todo o desenvolvimento na idade adulta é conhecida como eritropoiese. Um grande desafio na pesquisa de eritropoiese é definir os mestre reguladores que coordene o desenvolvimento de RBC e o interruptor entre eritropoiese primitivo e definitivo. Reprogramação de linhagem direta dos progenitores eritroide apresenta uma oportunidade de entender melhor eritroide desenvolvimento em vivo.
Linhagem direta reprogramação (DLR), também conhecido como transdiferenciação celular, é o processo de reprogramação de um tipo de célula diretamente em outro, ignorando pluripotentes e multipotentes progenitoras estágios. DLR até agora tem sido usado para produzir vários tipos de células, incluindo neural2e nefrótica7, células progenitoras hematopoiéticas3,4,5, hepática6 . Para os biólogos do desenvolvimento, DLR tornou-se uma ferramenta importante para interrogar os aspectos de compromisso linhagem e processos de diferenciação terminal8,9. DLR pode complementar e substituir parcialmente na vivo estudos para mecanismos de compreensão do destino célula fatores determinantes durante o desenvolvimento. O protocolo DLR para reprogramação de progenitores eritroide descritos neste artigo fornece o campo um método complementar para estudos do desenvolvimento da eritropoiese.
Nós demonstramos anteriormente que a superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente de progenitores eritroide induzida (iEPs) 10. the GTLM-reprogramado eritroide células assemelham-se grandemente bona fide eritroide primitivo progenitores em termos de morfologia, fenótipo e gene expressão10. Assim iEPs tem limitada capacidade de proliferação e amadurecer-se hemácias nucleadas similares àqueles produzidos transitoriamente no embrião precoce antes do início da eritropoiese definitivo. Fazendo alterações nas condições de reprogramação (por exemplo, mutações pontuais em reprogramação fatores ou adição de outros factores), pode-se entender como isso leva a alterações no desenvolvimento eritroide e diferenciação. Por exemplo mostramos que a adição de Klf1 ou Myb ao coquetel GTLM altera o padrão de expressão de globina de predominantemente embrionário (primitivo) para principalmente adultos (definitivo). Esta constatação corrobora a validade do uso de DLR como uma ferramenta para a definição de fatores do desenvolvimento na eritropoiese.
Aqui, podemos descrever o processo de geração iEPs de fibroblastos de ponta de cauda de rato (TTF). Em nossos resultados representativos, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor– Cre R26– eYFP) que expressam a proteína fluorescente amarela (eYFP) do locus Rosa26 em todas as células que expressaram o receptor de eritropoetina, permitindo a fácil visualização do compromisso com a linhagem eritroide. Usando esse método, YFP positivo (EpoR +) células estão presentes logo em cinco dias depois de transdução. Este protocolo, portanto, oferece uma técnica rápida e robusta para a geração de eritroide progenitores em vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente ao iEPs10. As células reprogramadas eritroide assemelhava-se muito bona fide eritroide progenitores em termos de morfologia, fenótipo, expressão gênica e formadoras de capacidade. Esta constatação corrobora o raciocínio d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonagem e Harvey Lodish (Instituto Whitehead) fornecendo muitos o plasmídeo utilizado para gerar a biblioteca retroviral. Agradecemos leiliane Siva e Sofie Singbrant (departamento de Medicina Molecular e Gene Therapy, Universidade de Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (departamento de Hematologia Molecular, Universidade de Lund) para os seus papéis na descrição da produção do iEP. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, parque de pesquisa biomédica de Barcelona), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, Nova Iorque), Carl Walkley (Instituto de pesquisa médica de St. Vincent e Departamento de medicina, Hospital de St. Vincent, Universidade de Melbourne), Ángel Raya (instituição catalã de investigação e estudos avançados, Barcelona) e G. de Vijay Sankaran (Broad Institute do Instituto de Massachusetts de tecnologia e Harvard, Cambridge ) por suas contribuições anteriores a este trabalho. Este trabalho foi financiado pela Fundação Ragnar Söderberg (a J.F.); o sueco de pesquisa Conselho (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (para J.F.); a Fundação sueca para a investigação estratégica (para J.F.); Fundação de Åke Wiberg (para J.F.); um subsídio de integração de Marie Curie (para J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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