Устные интубации взрослых рыбок данио: модель для оценки кишечного поглощения биоактивных соединений
Summary
Протокол описывает интубирование взрослых данио рерио с биологическими; затем рассечения и подготовка кишечника цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР. Этот метод позволяет администрации биоактивных соединений для мониторинга кишечного поглощения и местной иммунной стимул вызывали. Это актуально для тестирования кишечных динамика устных профилактики.
Abstract
Большинство возбудителей вторгнуться организмов через их слизистой оболочки. Это особенно верно в рыбе, как они постоянно подвергаются воздействию микробной богатые водной среды. Разработка эффективных методов для перорального Иммуностимуляторы или вакцин, которые активируют иммунную систему против инфекционных заболеваний, является весьма желательным. В разработке профилактических средств, хорошие экспериментальные модели необходимо проверить их эффективность. Здесь мы показываем, метод для устного интубации взрослых рыбок данио и набор процедур для вскрыть и подготовки кишечника цитометрии, confocal микроскопии и анализа количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот протокол мы точно можно администрировать тома до 50 мкл рыбы весом примерно 1 g просто и быстро, без ущерба для животных. Этот метод позволяет нам исследовать поглощения прямых в vivo дневно помечены соединений на слизистой оболочке кишечника и иммуномодулирующим потенциала таких биопрепаратов на локальном сайте после интубации. Объединив течению методы, такие как проточной цитометрии, гистология, ПЦР и confocal микроскопии кишечника ткани, мы можем понять, как возможность пересечь кишечной слизистой барьеров, проходят через lamina propria, иммуностимуляторы или вакцины и достичь мышцы, оказывая влияние на кишечной слизистой иммунной системы. Модель может использоваться для проверки кандидата устные профилактики и систем доставки или местное действие любого перорального биоактивных соединений.
Introduction
Цель этой статьи заключается в подробно описать простой метод для устного интубации данио рерио, наряду с полезной связанные течению процедур. Устные интубации, используя данио рерио стала практической моделью в изучении динамики инфекционного заболевания, устные вакцины/иммуностимулирующим, потребление наркотиков/наночастиц и эффективность и кишечной слизистой иммунитета. Например в исследовании Mycobacterium marinum и peregrinum микобактерий инфекции1был использован данио рерио устные интубации. Lovmo и др. также успешно используется эта модель для доставки наночастиц и м. marinum желудочно кишечного тракта у взрослых рыбок данио2. Кроме того, Чэнь et al. используется данио рерио устные интубации чтобы показать, что наркотики инкапсулируется наночастиц, когда управляемые через желудочно кишечного тракта, были перевезены через барьер мозга крови3. Эти авторы провели интубации, основанную на методе gauvage, характеризуется Коллимор et al. 4 с некоторыми изменениями. Однако они не обеспечивают весьма подробный протокол описания процедуры устного интубации. Здесь мы представляем метод для устного интубации взрослых рыбок данио, опираясь на Коллимор et al. 4 далее мы включают подготовку intestine для соответствующих течению анализа цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР.
Кишечника и особенно ее слизистой оболочки является первой линией обороны против инфекции и основной сайт питательных5. Когда клетки эпителия и антиген представляющих клеток в слизистой барьеры воспринимают сигналы опасности, запускается немедленно врожденный иммунный ответ. Далее,6,лимфоцитов T и B7устанавливается весьма специфический адаптивного иммунного ответа. Развитие устной вакцин является текущее направление в вакцинологии. Такие вакцины будет эффективным инструментом для защиты организма на открытых участках из-за конкретный ответ иммунных клеток в слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (MALT)8,9. В аквакультуре слизистой вакцины имеют очевидные преимущества, по сравнению с инъекционные вакцины. Они практичны для массовой вакцинации, менее трудоемкой, менее стрессовым для рыб и может назначаться молоди рыб. Тем не менее слизистой вакцин-кандидатов должны достичь второго сегмента кишки без денатурировано в устной окружающей среды. Они также должны пересекать слизистой барьеров для того, чтобы получить доступ к антиген представляющих клеток (БТР), чтобы побудить местных или системных ответов10. Таким образом тестирование слизистой поглощения, достигнутые устные антигены кандидат и систем их доставки, а также иммунный ответ вызвал, имеет важное значение в развитии устных вакцин.
В рамках биомедицинских разработка модели для тестирования биологических эффектов соединений после интубации в Оральный растущий интерес. Многие анатомические и физиологические функции кишечника консервируют между bilaterian линий, с11млекопитающих и костистых рыб. Эта модель устные интубации, подключенных к течению анализа может быть инструментом обеспечить понимание биологии человека, а также полигоном для biologics или других соединений в естественных условиях.
Протокол устное интубации могут выполняться одним оператором, например, успешно администрирование до 50 мкл суспензии наночастиц белок рыбы весом 1 g, с высокой выживаемости. Процедура проста в настройке и быстро; 30 рыб может быть интубированных в 1 час. Протокол для кишечника подготовки является ключом к обеспечению качества образцов клеток и тканей для последующего анализа. Приведены примеры течению результаты, которые показывают полезность протокола в получении данных, относящиеся к кишечного поглощения и изолировать РНК качества для ПЦР. Протокол будет весьма полезным для тех, кто нуждается подходящую модель для проверки динамика устных профилактики или других соединений в кишечнике.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является улучшение ранее описанные методики для устного интубации на Коллимор et al. 4 наши протокол подробно описывает метод устные интубации и включает в себя подготовку intestine вниз по течению анализа. Наш метод улучшает скорость манипуляции рыбы, позволя…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов от испанского министерства науки, Европейской Комиссии и AGAUR средства для NR (AGL2015-65129-R МИНЕКО/ФЕДЕР и 2014SGR-345 AGAUR). RT имеет предварительно докторской стипендии от AGAUR (Испания), JJ было поддержано PhD стипендии от Совета стипендию Китай (Китай) и NR поддерживается программой Ramón y Cajal (Исправительные-2010-06210, МИНЕКО, 2010). Мы благодарим д-р Торреальба для консультации экспертов в производстве белка, н. «Барба» от «Обслуживание де Microscopia» и д-р м. Коста от «Обслуживание de Citometria» на близлежащем автономном Университат де Барселона полезной технической помощи.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
