تنبيب الشفوي من الزرد الكبار: نموذج لتقييم امتصاص الأمعاء للمركبات النشطة بيولوجيا
Summary
وصف البروتوكول تنبيب الزرد الكبار مع البيولوجية؛ ثم تشريح وإعداد الأمعاء للخلوي والفحص المجهري [كنفوكل] وقبكر. هذا الأسلوب يسمح لإدارة مركبات النشطة بيولوجيا لرصد امتصاص الأمعاء والتحفيز المناعي المحلية آثار. أنها ذات صلة لاختبار المعوية ديناميات الوقائية عن طريق الفم.
Abstract
معظم مسببات الأمراض تغزو الكائنات عن طريق الغشاء المخاطي بهم. وهذا صحيح بصفة خاصة في الأسماك كما أنهم يتعرضون باستمرار لبيئة مياه الغنية بالجراثيم. تطوير أساليب فعالة لإيصال الفم immunostimulants أو اللقاحات، وتنشيط الجهاز المناعي ضد الأمراض المعدية، مرغوب فيه للغاية. في استنباط أدوات وقائية، هناك حاجة جيدة نماذج تجريبية لاختبار أدائها. هنا، نحن إظهار أسلوب تنبيب الشفوي من الزرد الكبار ومجموعة من الإجراءات لتشريح وإعداد الأمعاء للخلوي ومجهرية [كنفوكل] وتحليل سلسلة من ردود الفعل (qPCR) بوليميريز الكمية. مع أحكام هذا البروتوكول، ونحن تحديداً إدارة وحدات تخزين ما يصل إلى 50 ميليلتر الأسماك تزن حوالي 1 ز ببساطة وسرعة، دون الأضرار بالحيوانات. هذا الأسلوب يسمح لنا باستكشاف مباشرة في فيفو امتصاص مركبات فلوريسسينتلي المسمى مخاطية الأمعاء، وقدرة immunomodulatory مثل البيولوجي في الموقع المحلي بعد التنبيب. عن طريق الجمع بين أساليب المصب مثل التدفق الخلوي، علم الأنسجة، وقبكر ومجهرية [كنفوكل] الأنسجة المعوية، يمكننا أن نفهم كيف إيمونوستيمولانتس أو اللقاحات قادرة على عبور الحواجز المخاطية المعوية، وتمر من خلال بروبريا الصفيحة، و تصل العضلات، وممارسة تأثير على جهاز المناعة المخاطية المعوية. يمكن استخدام النموذج لاختبار المرشح عن طريق الفم الوقائية ومنظومات إيصالها أو تأثير المحلية أي مركب النشطة بيولوجيا تدار شفويا.
Introduction
والهدف من هذه المادة وصف في عمق طريقة واضحة تنبيب الشفوي من الزرد، جنبا إلى جنب مع الإجراءات المتلقين للمعلومات المفيدة المرتبطة بها. تنبيب الشفوي استخدام الزرد أصبح نموذج عملي في دراسة ديناميات الأمراض المعدية واللقاحات الفموية/منبه المناعة والإقبال على المخدرات/نانوحبيبات ونجاعة وحصانة المخاطية المعوية. على سبيل المثال، استخدمت الزرد تنبيب الشفوي في دراسة الإصابة بكتريا مارينوم و بكتريا بيريجرينوم 1. لوفمو et al. كما استخدمت بنجاح هذا النموذج لتقديم جسيمات نانوية و M. marinum للقناة الهضمية الزرد الكبار2. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تشن et al. الزرد تنبيب الشفوي لإظهار أن المخدرات مغلفة بجسيمات نانوية، عندما تدار عبر المسالك المعدية المعوية، ونقلت عبر حاجز الدم الدماغ3. أجرى المؤلفون هذه تنبيب استناداً إلى أسلوب جوفاجي وصف كوليمور et al. 4 مع بعض التعديلات. بيد أنها لا توفر بروتوكول مفصلة للغاية وصف الإجراء تنبيب الشفوي. وهنا نقدم طريقة للفم تنبيب للكبار الزرد بناء على كوليمور et al. 4 ونحن كذلك تشمل إعداد الأمعاء لتحليل المتلقين للمعلومات ذات الصلة الخلوي والفحص المجهري [كنفوكل] و qPCR.
الأمعاء، ولا سيما في الغشاء المخاطي هو الخط الأول للدفاع ضد العدوى والموقع الرئيسي لامتصاص المغذيات5. عند الخلايا الظهارية وعرض مستضد الخلايا ضمن الحواجز المخاطية يرون إشارات الخطر، يتم تشغيل استجابة فورية للمناعة فطرية. المقبل، هي الاستجابة المناعية التكيفية محددة للغاية الذي حددته تي وب لمفاوية6،7. تطوير اللقاحات الفموية مجال تركيز الحالي في اللقاحات. هذه اللقاحات ستكون أداة فعالة لحماية الكائنات الحية في مواقع مكشوفة نظراً لاستجابة محددة من الخلايا المناعية في8،الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (الشعير)9. في تربية الأحياء المائية، واللقاحات المخاطية قد مزايا واضحة مقارنة باللقاحات عن طريق الحقن. أنها هي العملية لتطعيم، أقل كثيفة العمالة وهي أقل إرهاقاً للأسماك ويمكن أن تدار لصغار الأسماك. ومع ذلك، يجب أن تصل إلى المرشحين لقاح مخاطية الجزء الثاني المتعلق بالقناة الهضمية دون يجري التشويه والتحريف في البيئة عن طريق الفم. أنها أيضا يجب أن تعبر الحواجز المخاطية بغية الوصول إلى مستضد تقديم الخلايا (Apc) للحث على الاستجابات المحلية و/أو النظمية10. ومن ثم اختبار امتصاص المخاطية التي حققها مرشح المستضدات الشفوي ومنظومات إيصالها، فضلا عن الاستجابة المناعية أثارت، أمر ضروري في تطوير اللقاحات الفموية.
في إطار الطب الحيوي، وضع نموذج لاختبار الآثار البيولوجية للمركبات بعد تنبيب الشفوي باهتمام متزايد. العديد من الميزات التشريحية والفسيولوجية للامعاء يتم المحافظة عليها بين الأنساب بيلاتيريان، مع الثدييات والأسماك العظمية11. نموذج تنبيب الشفوي هذا متصلاً بتحليل المتلقين للمعلومات يمكن أن يكون أداة لتوفير رؤى في البيولوجيا البشرية، فضلا عن ساحة اختبار للبيولوجي أو المركبات الأخرى في فيفو.
يمكن أن يؤديها البروتوكول تنبيب الشفوي إلى عامل واحد، مثلاً، إدارة بنجاح يصل إلى 50 ميليلتر من تعليق نانوحبيبات بروتين الأسماك تزن 1 غ، مع معدل البقاء على قيد الحياة عالية. الإجراء إجراء بسيط لإعداد وسريعة؛ يمكن تنبيب الأسماك 30 في ح 1. البروتوكول المتعلق بإعداد الأمعاء هو المفتاح لتوفير نوعية الخلايا والأنسجة وعينات لتحليلها لاحقاً. ترد أمثلة للنتائج النهائية التي تظهر فائدة البروتوكول في الحصول على البيانات ذات الصلة بامتصاص الأمعاء وعزل الحمض النووي الريبي نوعية ل qPCR. البروتوكول ستكون ذات فائدة كبيرة لأولئك الذين يحتاجون إلى نموذج مناسب لاختبار ديناميات الوقائية عن طريق الفم أو غيرها من المركبات في الأمعاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول تحسين تقنية هو موضح سابقا تنبيب الشفوي من كوليمور et al. 4 لدينا بروتوكول يصف بالتفصيل طريقة تنبيب الشفوي ويشمل إعداد الأمعاء لتحليلات المتلقين للمعلومات. لدينا طريقة تحسين سرعة التلاعب الأسماك السماح لشخص واحد لتنفيذ البروتوكول كله سريعاً، دون تباين كبير ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من الوزارة الإسبانية للعلوم واللجنة الأوروبية والصناديق عجور للمجلة (AGL2015-65129 آر مينيكو/FEDER وعجور 2014SGR-345). RT يحمل دكتوراه قبل منحة دراسية من عجور (إسبانيا)، ي ي وأيده على زمالة دكتوراه من “مجلس المنح الدراسية الصيني” (الصين) وتقرير وطني معتمد من قبل البرنامج رامون y كيال (تأهيل-2010-06210، 2010، مينيكو). ونحن نشكر الدكتور توريالبا على مشورة الخبراء في إنتاج البروتين، باربا أ من “ميكروسكوبيا دي سيرفي” والدكتور م. كوستا من “سيتوميتريا دي سيرفي” للمستقلة جامعة برشلونة للمساعدة التقنية مفيدة.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
