Luminophore-צורה הייצורים החיים השונים של אלבומין שור על-ידי איגוד של Gold(III)
Summary
הפרוטוקולים ללמוד את הכריכה של קטיונים זהב (Au(III)) כדי הייצורים החיים השונים של אלבומין שור (BSA), כמו גם אפיון הסתגלותי התלויים את ייחודי BSA-Au פלורסצנטיות מוצגים.
Abstract
המטרה של הפרוטוקולים הציג היא ללמוד את התהליך של Au(III) מחייב BSA, מניב פלואורסצנטי אדום הנוצרות על-ידי שינוי קונפורמציה (λem = 640 ננומטר) של מתחמי BSA-Au(III). השיטה מתאימה את ה-pH להראות כי הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא מתואם עם מעברים pH-induced שיווי משקל של הצורות BSA. קומפלקסים BSA-Au(III) ניאון אדום יכול להיווצר רק עם התאמה של pH או שמעליו 9.7, המתאים קונפורמציה “-טופס” BSA. פרוטוקול כדי להתאים את BSA ליחס טוחנת Au וכדי לפקח הקורס-הזמן של התהליך של איגוד Au(III) מתואר. המספר המינימלי של Au(III) לכל BSA, כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום, הוא פחות מ 7. אנו מתארים את הפרוטוקול בשלבים כדי להמחיש את הנוכחות של מספר אתרי קישור Au(III) ב- BSA. הראשון, על-ידי הוספת נחושת (Cu(II)) או ניקל (קטיונים Ni(II)) ואחריו Au(III), שיטה זו מגלה אתר איגוד עבור Au(III) זה לא fluorophore אדום. שנית, על ידי שינוי BSA מאת תיול מיצוי סוכנים, מתגלה אתר איגוד Au(III) להיוות nonfluorophore אחר. שלישית, שינוי קונפורמציה של BSA על ידי ביקוע וכיסוי מכבלי דיסולפידי, מומחשים את האתר של איגוד Au(III) אפשרי. הפרוטוקול המתואר, כדי לשלוט BSA הייצורים החיים מחייב Au(III), ניתן להחיל כלל ללמוד את האינטראקציות של האחר חלבונים ו קטיונים מתכת.
Introduction
תרכובת BSA-Au בתערוכה של אולטרה סגול (UV)-טמפרמנט פלואורסצנטי אדום, עם יוצא מן הכלל סטוקס shift, יש להיות מסונתז במקור מאת Xie ואח. 1. פלואורסצנטי אדום ייחודי ויציבה יכול למצוא יישומים שונים בתחומים כגון חישה2,3,4,5,6,7הדמיה או ננו-רפואה8 ,9,10,11,12,13. תרכובת זו נחקרה בהרחבה על ידי חוקרים רבים בתחום של ננו-מדע בשנים האחרונות14,15,16. המתחם BSA-Au פירשו Au25 nanoclusters. מטרת השיטה הציג היא לבחון את תרכובת זו בפירוט וכדי להבין ממה פלואורסצנטי אדום. לפי הגישה שהוצגו, הנוכחות של אתרים מרובים Au מחייבת, ומקור פלורסצנטיות, תחליף התגרענות יחיד-האתר של Au25 nanoclusters, ניתן לתיאור. אותה גישה יכול להיות מועסק כדי ללמוד איך אחרים חלבונים17,18,19 ומורכבת עם Au(III) יכול לשנות את המאפיינים פלורסנט פנימי שלהם.
הסינתזה של המתחם BSA-Au אדום-פלורסנט מחייבת פקד הצרים של היחסים טוחנת של BSA כדי Au (BSA:Au) על מנת למקסם את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ואת המיקום של הפסגות עירור פליטה מפה (EEM)20. ניתן להראות כי מספר אתרי קישור קיים עבור Au(III) לאגד, כולל קטע אספרגין (או Asp שבר, שאריות חומצה אמינית ארבע הראשונות ב- N-הסופית של BSA)21,22. חומצת אמינוth 34 ביותר של BSA (Cys-34) מוצג גם לתאם Au(III), להיות מעורב המנגנון של ה fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) אדום20. על ביקוע כל Cys-Cys קשרי דיסולפידי וכיסוי כל זריחה תיולים, אדום אינו מיוצר ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). אפשרות זו מציינת בצורך של Cys-Cys דיסולפידי חוב כמו האתר של איגוד Au(III) כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום.
טכניקות הכימיה חלבון לא היה בשימוש נרחב כדי ללמוד את מתחמי BSA-Au(III) בקהילה ננו-מדע. עם זאת, זה יהיה יקר להעסיק את הטכניקות הללו כדי להבין היבטים מסוימים של אלה מתחמי, כמו גם כדי להשיג הבנה מפורט של האתרים מחייב Au(III) BSA. מאמר זה נועד להראות כמה טכניקות אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרכובות BSA-Au(III) מוכן ב- pH 12 מפגינים פלואורסצנטי אדום-גל פליטה של λem= 640 nm כשהוא מתרגש עם אולטרה סגול (UV) λ אורex= 365 nm (איור 1 א’). הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא תהליך איטי ואת ייקח כמה ימים בטמפרטורת החדר, כדי להגדיל את העוצמה המקסימלית. מפעיל את התגובה ב 37 מעלות צל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. מאשר התמיכה של הדוכס ביקורים יוזמה מיוחדת, וולס פארגו קרן, קרן חברת פארמה, כמו גם קרנות הפעלה מ מאוניברסיטת צפון קרוליינה, שרלוט.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
References
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
- Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
- Chen, L. -. Y., Wang, C. -. W., Yuan, Z., Chang, H. -. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
- Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
- Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
- Daniel, M. -. C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
- Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681 (2007).
- Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
- Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885 (2012).
- Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853 (2014).
- Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
- Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
- Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
- Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591 (2011).
- Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
- Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
- Peters, T. . All About Albumin. , (1996).
- Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
- Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
- Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
- Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
- Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
- Peters, T., Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
- Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
- Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).
