Summary

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Published: August 22, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Abstract

Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de T helper 1 (Th1) células é uma maneira útil para avaliar o papel desempenhado pelas células T em uma resposta imune. Este protocolo descreve a diferenciação em vitro dos progenitores da medula óssea (BM) para obter granulócitos macrófagos colônia-estimulando factor (GM-CSF) derivado-células dendríticas (DCs). O protocolo descreve também a transferência adotiva de peptídeos ovalbumina (OVAp)-carregado DCs GM-CSF-derivados e as células T CD4 do ingênuo de ratos transgénicos OTII a fim de analisar na vivo ativação, proliferação e diferenciação de células Th1 do transferidas as células T CD4. Este protocolo contorna a limitação de puramente na vivo métodos impostas pela incapacidade de manipular ou selecione população celular estudado especificamente. Além disso, este protocolo permite que estudos em um ambiente em vivo , evitando assim alterações funcionais fatores que podem ocorrer em vitro e inclusive a influência dos tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos. O protocolo é uma ferramenta útil para gerar mudanças em DCs e T células que modificar adaptáveis respostas imunes, potencialmente, fornecendo resultados importantes para compreender a origem ou o desenvolvimento de inúmeras doenças associadas imunes.

Introduction

Células T CD4 e apresentadoras de antígenos (APCs) de células como DCs são necessários mediadores da imunidade a patógenos microbianos1,2. Nos órgãos linfoides secundários, as células T CD4 são ativadas mediante reconhecimento de antígenos específicos apresentados por APCs3,4,5. Células CD4 T ativadas proliferaram e diferenciarem em células de Th effector específicos distintos que são necessárias para o desenvolvimento de uma correta resposta imune adaptativa6,7. Controle desses processos é fundamental para produzir uma defesa adequada adaptável que mata o patógeno sem produzir dano de tecido prejudicial8. Células th são definidas de acordo com a expressão ou a produção de moléculas de superfície, fatores de transcrição e citocinas efetoras e executam funções essenciais e precisas em resposta a agentes patogénicos1. Células do subconjunto de células Th1 expressam o fator de transcrição T-aposta e a citocinas interferon γ (relato) e participarem na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares1. Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 é um meio útil de avaliar a T células dramatização em uma resposta imune.

Este protocolo permite que vivo em análise da capacidade de in vitro –gerado DCs BM-derivado de modular o ativação, proliferação e diferenciação de Th1 de células T CD4 de ingênuo. O protocolo também serve para avaliar a capacidade das células T CD4 de ingênuo para ser ativado, induzidas a proliferar e Th1 diferenciadas (Figura 1). Este protocolo versátil contorna a incapacidade especificamente manipular ou selecione população celular estudados em puramente na vivo protocolos. Os efeitos de diversas moléculas e tratamentos em controladores de domínio podem ser estudados usando BM de camundongos geneticamente modificados5 ou tratar ou manipular geneticamente isolados de células BM9. Da mesma forma, respostas de células T podem ser exploradas através da obtenção de células T para transferência adotiva de diferentes fontes ou após várias manipulações3,8,10.

As principais vantagens do presente protocolo são dupla. Ativação de célula t, proliferação e diferenciação de células Th1 são analisados com uma abordagem de citometria de fluxo; e isto é combinado com estudos em vivo , evitando, assim, alterações que podem ocorrer em vitro , incluindo tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos11.

O uso de corantes vitais é uma técnica amplamente utilizada para controlar a proliferação celular, evitando o uso da radioactividade. A medida da proliferação com estes reagentes baseia-se na diluição do corante após a divisão celular. Além disso, esses corantes podem ser detectados em vários comprimentos de onda e são facilmente analisadas por citometria de fluxo em combinação com vários anticorpos fluorescentes ou marcadores. Destacamos a utilidade do presente protocolo, mostrando como a ativação de célula T, proliferação e diferenciação de células Th1 podem ser analisados por citometria de fluxo.

Protocol

Procedimentos experimentais foram aprovados pela Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e da Comunidad Autónoma de Madrid, em conformidade com diretrizes de espanhol e europeus. Os ratos foram criados em condições (SPF) livre de patógeno específico e foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono (CO2). 1. isolamento de células de medula óssea de rato de tíbias e fêmures Nota: A cepa de rato C57BL…

Representative Results

A Figura 1 ilustra as etapas descritas neste protocolo. A Figura 2 ilustra o isolamento e a cultura de células de rato BM. A adição de GM-CSF e LPS para essas culturas permite a geração em vitro e maturação de DCs. a Figura 3 ilustra a análise de citometria de fluxo da diferenciação e maturação de obtidos DCs DCs. OVAp-carregado derivado de GM-CSF BM e célula vital isolado rastr…

Discussion

Este protocolo permite a caracterização da capacidade de DCs BM-derivado de modular a ativação, proliferação e diferenciação das células T CD4 de ingênuo. Além disso, ele pode também ser usado para avaliar a suscetibilidade de células T CD4 a modulação por DCs BM-derivado. Com este protocolo, mudanças nestes eventos podem ser medidos em vivo.

Dependendo da hipótese sob investigação, várias combinações de células T e DCs podem ser usadas. Por exemplo, um pode ana…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Simon Bartlett para edição inglesa. Este estudo foi suportado por concessões do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), o programa de Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; com o co-financiamento do Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). A CNIC é suportado pelo Ministério da economia, da indústria e competitividade (MEIC) e Fundação Pro CNIC e é um Severo Ochoa centro de excelência (SEV-2015-0505). RTF é fundada pela Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG por ISCIII, BHF pelo Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G pelo ISCIII Miguel Servet programa e imas12.

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

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Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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