Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Monocitos, neutrófilos y células dendríticas (DCs) son células mieloides que provienen de progenitores hematopoyéticos, principalmente en la médula ósea, por un proceso llamado mielopoyesis. Progenitores mieloides comunes (CMPs) tienen el potencial para producir células mieloides, así como megacariocitos y eritrocitos, pero las células no linfoides. Progenitores de granulocitos-monocitos (BPF), que se derivan de los CMPs, producen granulocitos y monocitos, pero han perdido megakaryocyte y el potencial del eritrocito. Monocitos y clásica y plasmacytoid DCs (CDC/PDC) también se piensan para presentarse de progenitores comunes conocidos como progenitores de monocito DC (MDPs), que son producidos por CMPs. Gradual restricción potencial del linaje que finalmente se traduce en linaje comprometido progenitores: progenitores de granulocitos, monocito progenitores y progenitoras de células dendríticas (figura 1).

Weissman y sus colegas informaron que los CMPs se encuentran en Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– CD34 (LKS^–)⁺ FcγR^lo fracción de médula ósea de ratón, mientras que las prácticas correctas de fabricación están contenidos en el CD34 LKS^{– +} FcγR ^Hola fracción¹. Sin embargo, estas fracciones “CMP” y “GMP” son muy heterogéneas. Por ejemplo, la fracción de “GMP” también contiene progenitores comprometidos linaje granulocito monocito progenitores y^1,2. MDPs se informaron por separado que CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitores que también expresan CD34 y FcγR^3,4. MDPs dan lugar a cDC/pDC-producción común DC progenitores (CDP), que se han divulgado para expresar niveles más bajos de c-Kit (CD117) y no están incluidos en la fracción LKS^{– 5}.

Previamente, fue asumido que los monocitos surgen a través de una sola vía (CMP-GMP-MDP-monocito). Consistente con este modelo, cometidos por el monocito progenitores producida por prácticas correctas de fabricación (nombre de progenitores de monocitos, MPs)² y MDPs (nombradas de progenitores comunes de monocitos, cMoPs)⁶ parecen ser las células del mismo en base a la expresión del marcador de superficie compartido . Sin embargo, nosotros recientemente demostró que los monocitos son producidos independientemente por GMPs y MDPs y fueron capaces de distinguir entre el MPs y el cMoPs unicelular RNA la secuencia⁷.

Recientemente modificamos la estrategia bloquea “GMP” y Weissman “CMP” para identificar 6 subfracciones de médula de ratón C57BL/6J que contiene diferentes oligopotent y subconjuntos de progenitor mieloide linaje comprometido. Primero nos informan que la coloración de Ly6C y CD115 permite el aislamiento de oligopotent correctas, como progenitores de granulocitos (GPs) y progenitores de monocitos (MPs y cMoPs, que actualmente no podemos separar) del “GMP” fracción² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^Hola puerta; Figura 1). Posteriormente demostró que MDPs se encuentran predominantemente en la fracción “CMP” (CD34 LKS^{– + lo} puerta de FcγR), que también contiene Flt3⁺ CD115^lo y Flt3^– subconjuntos⁷ (figura 1 ). El CMP-Flt3⁺ CD115^lo fracción rinde GMPs y MDPs sobre transferencia adoptiva. El CMP-^– de Flt3 subconjunto contiene progenitores que parecen intermedios entre CD115 CMP-Flt3^{+ lo} y las células correctas. A diferencia de MDPs, CD115 CMP-Flt3^{+ lo} tanto fracciones de CMP-Flt3^– también poseen megakaryocyte y el potencial del eritrocito.

Es importante señalar, sin embargo, que no está actualmente claro si las fracciones “CMP” contienen progenitores que son realmente oligopotent (por ejemplo, las células individuales en el CMP-Flt3⁺ CD115^lo fracción que poseen del neutrófilo, monocito DC, megacariocitos y eritrocito potencial), o alternativamente, comprenden una mezcla de progenitores con potencial más restringido de linaje. Formadoras de ensayos (culturas de metilcelulosa) revelaron las células con granulocitos (neutrófilos), eritrocitos, monocitos y potencial de megacariocitos (células GEMM) en la “AMC”, CMP-⁺ CD115^lo de Flt3 y fracciones de CMP-Flt3^{– 1 ,7}, pero no permiten la evaluación del potencial de DC. En cambio, formadoras de ensayos demostraron la existencia de oligopotent correctas (progenitores con recuento de neutrófilos y monocitos potencial) en el “GMP” fracción^1,2, y esto es apoyado por recientes unicelular de análisis transcriptómico⁸. No se actualmente sabe, sin embargo, si estos oligopotent BPF también produce otros granulocitos (eosinófilos, basófilos y mastocitos).

Basado en estos estudios, ahora demostramos cómo 7 superficie marcadores (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C y CD115) puede utilizarse para identificar y aislar estos 6 subconjuntos de oligopotent y de progenitores mieloides linaje comprometido. El protocolo descrito aquí puede ser aplicado para en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido), en vivo experimentos transferencia adoptiva en ratones y el análisis molecular (secuencia de RNA a granel y unicelular, Western blotting, etc.).

El protocolo consta de 3 etapas: 1) preparación de una suspensión unicelular de la médula ósea las células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos (clasificación celular activada por el magnético) y 3) la identificación y aislamiento si lo desea, de subconjuntos del progenitor por flujo Citometría (mediante un analizador o un clasificador, según sea el caso). El primer paso es el aislamiento de las células de la médula ósea de los fémures y tibias de ratones eutanasia y es similar a otros protocolos previamente descritos⁹. A continuación, la muestra es enriquecida de células madre y progenitoras utilizando un cóctel de anticuerpos contra los marcadores de superficie celular de los eritrocitos, neutrófilos, monocitos, linfocitos, etc., para agotar las células diferenciadas. Esto no es obligatorio, pero se recomienda fuertemente para optimizar la detección de los subconjuntos de la progenitora y a reducir la cantidad de anticuerpos necesarios para la identificación del progenitor y el tiempo necesario para citometría de flujo. El protocolo de agotamiento del linaje más abajo describe Magnetic-Activated celular clasificación (MACS) usando un ratón linaje celular agotamiento Kit (que contiene anticuerpos biotinilados contra CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 y Ter-119, más anti-biotina microesferas) y un separador magnético automatizado. El paso final es la identificación (y ordenar, si lo desea) de los subconjuntos de progenitoras por citometria de flujo. El panel de anticuerpos se describe a continuación (ver también tabla 1) ha sido diseñado para ser utilizado en un citómetro de flujo (analizador o clasificador) con 4 rayos láser (405 nanómetro, 488 nanómetro, 561 nm, 640 nm).

Figura 1: vías de diferenciación y progenitores de neutrófilos, monocitos y DC. El modelo recientemente revisado de mielopoyesis⁷ se ilustra, con las puertas de Weissman “CMP” (azul) y “Correctas” (verde)¹ overlaid. Esta figura ha sido modificada desde Yáñez et al. 2017⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.