寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

単球、好中球、樹状細胞 (Dc) は、イエウサギと呼ばれるプロセスによって主に骨髄での造血前駆細胞から生じる骨髄系の細胞です。一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp の) 骨髄細胞と同様に巨核球、赤血球、ないリンパ様細胞を生成する可能性があります。顆粒球単球前駆細胞 (適性) Cmp から派生した、顆粒球、単球が巨核球と潜在的な赤血球を失っています。単球および古典的な樹状 (cDCs/Pdc) も Cmp 徐々 に分化能の制限の血統で、コミット結果最終的によって作り出される球 DC 前駆細胞 (MDPs) として知られている共通の前駆細胞から生じると考えられている。前駆細胞: 顆粒球前駆細胞、単球前駆細胞、樹状細胞前駆細胞 (図 1)。

ワイズマンと同僚の報告林^– c-キットに⁺ Sca-1^– (^–以下 LKS) CD34 既に報告がある⁺ FcγR^loの一部マウス骨髄、省は、LKS^– CD34 に含まれている間⁺ FcγR^{こんにちは}分数¹。しかし、これらの”の CMP”と”GMP”分数が非常に異質です。たとえば、”GMP”分数には、リネージュ コミット顆粒球前駆細胞と単球前駆細胞^1,2も含まれています。CX3CR1 をこと MDPs が別々 に報告された⁺ Flt3⁺ CD115⁺前駆細胞 CD34 と FcγR^3、4を表す。MDPs は、cDC/pDC 生産共通 DC 前駆細胞 (Cdp)、c-Kit (CD117) のより低いレベルを表現する報告されてきたを生じ、LKS^–一部⁵には含まれません。

それは従来の単一経路 (CMP-GMP-民主党-単球) 単球が発生する予想。(単球前駆細胞、MPs の名前) 省によって生成されるこのモデル, 単球コミット前駆細胞と一貫性のある²と (一般的な単球前駆細胞、cMoPs の名前) MDPs⁶共有表面マーカー式に基づいて同一の細胞のように見える.しかし、我々 は最近単球によって生産されているいない独立して省と MDPs、実証、単一細胞 RNA シーケンス⁷MPs と cMoPs を区別することができた。

最近、c57bl/6 j マウス骨髄異なる寡能性と系統コミットの myeloid 祖先のサブセットを含む 6 亜分画を識別するワイズマン”の CMP”と”GMP”ゲート戦略を変更しました。寡能性省と同様、顆粒球前駆細胞 (GPs) と単球前駆細胞 (MPs および cMoPs は、我々 は現在を区切ることができない) の隔離を可能に Ly6C と CD115 のために汚れることをまず報告”GMP”分数² (LKS から^–CD34⁺ FcγR^{こんにちは}ゲート;図 1)。我々 はその後 MDPs は”の CMP”の割合で主に見られることを実証 (LKS^– CD34⁺ FcγR^loゲート)、Flt3 が含まれている⁺ CD115^lo Flt3^–サブセット⁷ (図 1).CMP Flt3⁺ CD115^lo分数は、養子の転送時に適性と MDPs を生成します。CMP Flt3^–のサブセットには、CMP Flt3⁺ CD115^lo細胞と省の間の中間体のように見える前駆細胞が含まれています。MDPs とは異なり両方、CMP Flt3⁺ CD115^loおよび CMP Flt3^–分数も所有している球および赤血球の潜在的です。

ただし、”の CMP”分数に寡能性 (例えば、個々 のセル CMP Flt3⁺ CD115^lo分数内好中球を所有していることは、本当に前駆細胞が含まれているかどうかは現在のところ明確のことにそれが重要です。単球、DC、巨核球、および潜在的な赤血球)、または、代わりより制限されている血統で、潜在的な前駆細胞の混合物を構成します。コロニー形成アッセイ (セルロース文化) 明らかに細胞顆粒球 (好中球)、赤血球、単球、巨核球潜在的な (ジェム細胞)”CMP”の CMP Flt3⁺ CD115^loと CMP Flt3^{– 1 、7}、直流電位の評価を許可しないが。対照的に、コロニー形成アッセイ”GMP”分数^1、2、寡能性適性 (好中球と単球の潜在的な前駆細胞) の存在とこれは最近単一セルによってサポートされてトランスクリプトーム解析⁸。それは現在知られていない、しかし、これらの寡能性適性はまた他の顆粒球 (好酸球、好塩基球、肥満細胞) を生成するかどうか。

今を示すこれらの研究に基づいて 7 表面のマーカー (cd34 陽性、FcγR、Flt3、Ly6C と CD115 の c キット、Sca-1) 使用でき、寡能性と系列拘束された骨髄前駆細胞のこれらの 6 のサブセットを分離します。体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化) のここで説明されているプロトコルを適用ことができますマウス、および分子解析 (バルクで単一細胞の RNA シーケンス、西部にしみが付くこと、の生体内で養子転送実験など)。

プロトコルは 3 つの段階で構成されています: 1) 骨髄の単一細胞懸濁液調製された細胞、2) (磁気活性化細胞ソーティング)、造血前駆細胞、3) 識別、および分離の流れによって前駆細胞サブセットの望まれた場合の濃縮フローサイトメトリー (適切なアナライザーまたは、ソーターを使用)。最初のステップは、大腿骨から骨骨髄細胞の分離と安楽死させたマウスの脛骨、⁹その他の前述のプロトコルに似ています。次に、サンプルは、幹・前駆細胞の赤血球、好中球、単球、リンパ球などの細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを使用して分化した細胞を破壊するために濃縮されています。これは必須、前駆細胞のサブセットの検出を最適化し、前駆細胞の識別に必要な抗体とフローサイトメトリーに必要な時間の量を低減する強くお勧めします。以下の血統の枯渇プロトコル説明 Magnetic-Activated セルの並べ替え (MAC) のいずれもマウス系統の細胞枯渇キットを使用して (CD5、CD45R ビオチン化抗体が含まれている (B220) テル-119、Gr-1 (Ly6G/C)、7-4、CD11b 反ビオチン プラスマイクロ ビーズ) と自動磁選機。最後のステップは、識別 (と必要な場合、並べ替え) フローサイトメトリーによる前駆細胞サブセットの。抗体パネルが下記 4 レーザーで流れの cytometer (アナライザーまたは選別機) で使用する設計されています (テーブル 1を参照してください) (405 488 nm nm、561 nm、640 nm)。

図 1: 好中球、単球および DC 前駆細胞と分化経路。”Cmp”(青)、「適性」(グリーン)¹オーバーレイ ワイズマン ゲート イエウサギ⁷の最近改正されたモデルを示します。この図は、ヤーニェスら2017⁷から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。