Jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable

Todos los procedimientos realizados en sujetos animales vertebrados fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Harvard. 1. fabricación de la malla electrónica Nota: El procedimiento descrito en esta sección debe usarse dentro de una instalación de sala limpia Universidad estándar, como el centro para sistemas a nanoescala (CNS) en la Universidad de Harvard. Esta instalación, así como instalaciones similares son accesibles para usuarios externos en los Estados Unidos, por ejemplo, como parte de la red de infraestructura de nanotecnología nacional (NNIN) apoyado por la National Science Foundation (NSF). En estas instalaciones, muchas de las herramientas, equipos y materiales descritos en esta sección se proporcionan junto con el acceso a las instalaciones de sala limpia y no requiere compra por separado. PRECAUCIÓN: Muchos de los productos químicos utilizados en la fabricación de la malla electrónica son peligrosos, como resiste, CD-26, removedor PG, SU-8 desarrollador, Ni solución de la aguafuerte. Consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) para estos productos químicos antes de usar y aplicar y seguir las medidas de seguridad adecuadas en todo momento. Térmicamente se evaporan 100 nm de Ni sobre una oblea de Si limpiarla.Nota: Parámetros de deposición típica son presión base de 5 x 10-7 T y tasa de 1 – 2 Å/s. La fina capa de Ni sirve como una capa sacrificial que se disolverá más adelante para liberar la malla electrónica de la oblea. Utilice la primera máscara de PL (máscara de PL-1) para definir el fondo pasivado de capa de la malla electrónica con SU-8 photoresist negativo (figura 2A).Nota: PL es una técnica de microfabricación estándar en que luz ultravioleta (UV) es brilló en una máscara que se llevó a cabo sobre un sustrato fotosensible. Luz o hace insoluble (resistencia negativa) o soluble (resistente a positivo) las zonas expuestas sobre el sustrato. Las máscaras son dibujadas en software de diseño asistido por ordenador y ordenó entonces por lo general de un vendedor. Un alineador de máscara se utiliza para alinear máscaras a patrones existentes en un substrato y exponerlos a la luz UV. Fabricación de la malla electrónica requiere cuatro diferentes máscaras (máscara PL-1 a través de la máscara de PL-4). Nuestros diseños de la máscara están disponibles por solicitud o desde el sitio de recursos, meshelectronics.org. Spin-capa SU-8 2000.5 photoresist negativo sobre la oblea a 4.000 rpm para un espesor aproximado de SU-8 de 400-500 nm. Cocer al horno suave la oblea sobre una placa durante 1 min a 65 ° C seguido de 1 min a 95 ° C. Cargar la oblea en un alineador de máscara para exponer SU-8 con máscara de PL-1 correspondiente a la capa inferior de malla SU-8. Exponga a una dosis de i-line (longitud de onda 365 de nm) de 100 mJ/cm2. Puesto cueza al horno la oblea sobre una placa durante 1 min a 65 ° C seguido por 1 min a 95 ° C. Sumerja la oblea en una bandeja del revelador de SU-8. Frote suavemente la solución por 2 minutos hasta que el patrón de malla en el SU-8 ha sido completamente desarrollado. Enjuagar en una bandeja de alcohol isopropílico por 1 min y golpe seco. Duro, cueza al horno la oblea en la placa caliente a 180 ° C durante 1 hora.Nota: SU-8 cuesta normalmente al horno entre 150 ° C y 250 ° C después de desarrollo. El duro cuece al horno recuece cualquier grieta en la superficie que se puede formar durante el desarrollo y vínculos cruzados más la SU-8 para asegurar la estabilidad mecánica. Duro para hornear a 180 ° C para la capa inferior de SU-8 y 190 ° C para la parte superior capa SU-8 rinde buenos resultados para la malla electrónica. Interconexiones de use PL máscara-2 definir metal y placas de I/O (figura 2B). LOR3A capa Spin sobre la oblea a 4000 rpm para un grosor aproximado de 300 nm.Nota: LOR3A es un polydimethylglutarimide basado en resistir que velocidades socavando durante el procedimiento de metalización posterior. Cueza al horno la oblea en la placa caliente a 180 ° C durante 5 minutos. Spin-capa S1805 photoresist positivo a 4000 rpm para un espesor aproximado de 500 nm. Cueza al horno la oblea en una placa caliente a 115 ° C durante 1 minuto. Cargar la oblea en un alineador de máscara a exponer S1805 con máscara de PL-2 correspondiente al metal interconecta y almohadillas de I/O. Exponga a una dosis de la línea h (longitud de onda 405 de nm) de 40 mJ/cm2. Sumerja la oblea en una bandeja de CD-26 fotoresistencia desarrollador. Frote suavemente la solución por 1 minuto hasta que el metal interconecta patrón ha sido completamente desarrollado. Enjuague en una bandeja de agua desionizada (DI) durante 1 min y golpe seco. Térmicamente se evaporan 3 nm de Cr seguido de 80 nm de Au.Nota: Una presión base de a más 5 x 10-7 T y tasa de deposición de 1 Å/s típicamente producen la mejor calidad de la película. Sumerja la oblea en un vaso plano de removedor de PG de aproximadamente 3 h hasta que el metal ha socavado completamente, dejando el metal sólo en las regiones de almohadilla de I/O de la malla electrónica e interconexión deseada. Enjuague en alcohol isopropílico y golpe seco. Usar máscara de PL-3 definir electrodos de Pt (figura 2). Repita los pasos 1.3.1 a través de 1.3.4. Cargar la oblea en el alineador de máscara para exponer la S1805 con máscara de PL-3 correspondiente a los electrodos de Pt. Exponga a una dosis de la línea h de 40 mJ/cm2. Sumerja la oblea en una bandeja de CD-26 fotoresistencia desarrollador. Frote suavemente la solución durante 1 minuto hasta que el patrón de los electrodos de Pt se ha desarrollado completamente. Enjuagar en una bandeja de DI de 1 min y golpe seco. Utilizar un evaporador de haz de electrones al depósito 3 nm de Cr seguido de 50 nm de Pt.Nota: Parámetros de deposición típicos son una presión base de 5 x 10-7 T y la frecuencia de 2 Å / s. Sumerja la oblea en un vaso plano de removedor de PG de aproximadamente 3 h hasta que el metal ha socavado completamente, dejando el Pt sólo en los sitios de electrodo deseada de la red electrónica. Enjuague en alcohol isopropílico y golpe seco. Utilice máscara de PL-4 para definir la parte superior pasivado de capa de la malla electrónica con SU-8 photoresist negativo (Figura 2D). Repita los pasos 1.2.1 a través de la 1.2.5, excepto exponer con máscara de PL-4 correspondiente a la capa superior de la malla de apaciguamiento de SU-8. Duro, cueza al horno la oblea en la placa caliente a 190 ° C durante 1 hora.Nota: Esta temperatura es 10 ° C más alta que para el duro cuece al horno de la parte inferior SU-8 (paso 1.2.6). Esta elevada temperatura ligeramente ajusta la parte inferior SU-8, haciendo que se funden con la capa superior de SU-8 y así formar una sola estructura continua SU-8. Malla electrónica están ahora completos (Figura 2E y figura 3); liberarlas de la oblea de Si disolviendo la capa sacrificial Ni. Tratar la oblea con plasma de oxígeno 50 W durante 1 minuto. Esto oxida la superficie de SU-8, lo que es hidrofílico y permitiendo la malla ser fácilmente suspendido en una solución acuosa. En un recipiente plano, combinan ácido clorhídrico, cloruro férrico y DI en una proporción volumétrica de 1:1:20, respectivamente, para hacer una solución de reactivo Ni. Sumerja la oblea en un recipiente plano de la solución de reactivo Ni para aproximadamente 3 h hasta que la malla electrónica totalmente ha sido liberada de la oblea de Si. Utilice una pipeta Pasteur transferir la malla lanzada sondas electrónica de grabador Ni un vaso de precipitados de 100 mL de DI. Transferir la malla electrónica a un vaso de fresco de DI por lo menos 3 veces para enjuagar. Utilice una pipeta Pasteur transferir la malla electrónica a una solución de 70% / 30% etanol/agua para la desinfección, luego use la pipeta para transferir la malla electrónica al agua estéril para enjuagar.Nota: Después de la esterilización, la malla electrónica puede transferirse a otras soluciones para la funcionalización. Por ejemplo, para promover la adhesión celular, la malla electrónica puede transferirse a una solución acuosa de poly-D-lisina (1 mg/mL) durante 24 h. Uso una pipeta Pasteur transferir la malla electrónica sondas un vaso de precipitados de 100 mL de fosfato estéril 1 x tampón salino (PBS) antes de la inyección en vivo. 2. carga de la malla electrónica en agujas El titular de pipeta como comprada es abierto en ambos extremos del flujo. Selle el extremo opuesto el sujetador de tornillo redondo con resina epóxica, por lo que no hay fugas durante la inyección (Figura 4A). Que el epóxico endurezca antes de proceder. Inserte una aguja capilar de vidrio en el soporte de la pipeta. Fijarlo con el tornillo de apriete redondo y arandela cónica (Figura 4B). Se utiliza una 400 μm diámetro interior (diámetro externo de 650 μm) vidrio capilar aguja de este protocolo. Otros materiales de aguja capilar (e.g., metal) y diámetros pueden utilizarse pero podrían requerir cambios en el diseño de la malla electrónica para inyectabilidad.Nota: Las agujas capilar desde 150 μm hasta 1,17 mm de diámetro interior (250 μm a 1,5 mm de diámetro externo) se han utilizado en nuestro laboratorio. Inyección a través de agujas más pequeñas puede ser promovida por haciendo el ángulo de intersección entre los elementos de acoplamiento de SU-8 transversales y longitudinales más agudos, disminuyendo la anchura de los elementos de la malla de SU-8, con SU más delgado-8 y usando un más grueso (es decir., celda más grande) estructura de malla. Patrones de mallas diseñadas para pequeñas agujas capilares están disponibles por solicitud o desde el sitio de recursos, meshelectronics.org. Agujas capilares de vidrio con un diámetro interior de 400 μm y diámetro exterior de 550 μm están también disponibles comercialmente. Estos reducen el daño de tejido aguda causado por la inyección mientras que mantiene la compatibilidad con mallas que requieren 400 μm de diámetro interno, pero no fueron utilizados para los estudios descritos aquí. Conecte una jeringa de 1 mL a la salida del titular de la pipeta con una longitud de 2-4 cm de tubo capilar. Inserte la aguja capilar de vidrio en el vaso de precipitados de 100 mL de PBS con la malla electrónica. Coloque el extremo de la aguja cerca de los topes de I/O de una malla electrónica probe y retrae manualmente la jeringa para extraer una sonda electrónica de malla dentro de la aguja (figura 5 y complementario 1 de Video).Nota: Los pads de I/O, vástago interconectar región y región del dispositivo de acoplamiento son fácilmente identificables por el ojo desnudo las malla electrónica sondas suspendidas en solución. Esto permite cargar sin ambigüedades de la malla electrónica las agujas con la orientación correcta. Empuje/tire el émbolo de la jeringa mientras sigue inmerso en una solución salina para ajustar la posición de la malla electrónica dentro de la aguja.Nota: Posición Ideal es con la malla ultraflexible dispositivo región cerca de la punta de la aguja como sea posible. Esta configuración reduce al mínimo el volumen de líquido que se inyecta en el cerebro al mismo tiempo garantizando que la región dispositivo se inyecta primero y las almohadillas de I/O última. Separar con cuidado el tubo capilar de la salida del titular de la pipeta. Separe lentamente para evitar la creación de una fuerza de succión que podría alterar la posición de la malla electrónica dentro de la aguja. 3. estereotáxicas inyección de malla electrónica en cerebro de ratón vivo Nota: Los ratones fueron anestesiados por inyección intraperitoneal con una mezcla de 75 mg/kg ketamina y 1 mg/kg de dexdomitor. El grado de anestesia fue verificado con el método del pellizco del dedo del pie antes de comenzar la cirugía. Temperatura corporal fue mantenida colocando el ratón sobre una manta homeotérmicos de 37 ° C mientras que bajo anestesia. Se implementó una técnica aséptica adecuada para la cirugía, incluyendo pero no limitado a autoclave todo metal instrumentos quirúrgicos para 1 h antes de su uso, utilizando guantes esterilizados, utilizando un esterilizador de bolas calientes a lo largo de la cirugía, el mantenimiento de un campo estéril alrededor del sitio quirúrgico, la desinfección de instrumentos de plástico con etanol al 70% y el cuero cabelludo depilado piel fue preparada con yodoforo antes de la incisión. Para las cirugías de sobrevivencia, después de la conclusión de la cirugía, ejemplo el ungüento se aplicó alrededor de la herida, y el ratón volvió a una jaula equipada con a 37 ° C cojín de calefacción. Ratones no quedaron sin vigilancia hasta que había recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Ratones recibieron analgesia de buprenorfina vía inyección intraperitoneal a dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal cada 12 h hasta 72 h después de la cirugía. Ratones fueron aislados de otros animales después de la cirugía. Ratones fueron sacrificados o inyección intraperitoneal de pentobarbital en dosis de 270 mg/kg de peso corporal o mediante perfusión de transcardial (ver paso 6.1). Los investigadores pueden referirse a Geiger, et al. 30, Kirby, et al. 31y Gage, et al. 32 para más detalles sobre roedor cirugía estereotáctica. Anestesiar el ratón y colocarlo en un marco de estereotáctica. Aplicar lubricante ocular en ojos de ratón para prevenir sequedad mientras que bajo anestesia. Utilice un taladro dental y marco estereotáctica para abrir una craneotomía en las coordenadas deseadas en el cráneo. Abra una segunda craneotomía lejos del sitio de la inyección para la inserción de un tornillo de puesta a tierra de acero inoxidable o alambre. Fijar un sustrato de fijación al cráneo con cemento dental. Corte una amplia brecha de aproximadamente 1 mm en el sustrato para mejorar la fiabilidad de la plegable paso más adelante en el procedimiento.Nota: Un cable plano flexible (FFC) corte a una “L” forma funciona bien (Figura 7A), aunque muchos materiales trabajaría como son del espesor correcto para el 32-canal cero conector de force (ZIF) de inserción (diseñada para cables gruesos de 0,18 ± 0,05 mm). Monte el soporte de la pipeta con la aguja que contiene la malla electrónica en el armazón estereotáctica usando una abrazadera de ángulo recto final (figura 4 y figura 6A). Conecte la salida de la titular de la pipeta a una jeringa de 5 mL en una jeringa (figura 6) la bomba utilizando un aproximadamente 0,5 – 1 m de longitud de tubo capilar.Nota: Asegúrese de que hay no hay burbujas en el tubo capilar antes de conectarlo al titular de la pipeta. Las burbujas pueden interrumpir el flujo durante la inyección y prevenir una entrega suave y controlada de la malla electrónica. Utilizar el marco estereotáctica para colocar la punta de la aguja en la posición partida deseada dentro del cerebro.Nota: Las malla electrónica sondas aquí están diseñadas con grabación electrodos extendió sobre una longitud de aprox. 2 mm de espesor y con el primer electrodo situado aprox. 0,5 mm desde el borde inicial de la electrónica de red (borde izquierdo en la Figura 3A). Por esta razón, se deben seleccionar las coordenadas estereotáxicas tales que la ubicación inicial es 0,5 mm más profunda que la región cerebral de interés. La extensión y ubicación de los electrodos de grabación dentro de malla electrónica pueden seleccionarse libremente durante el proceso de diseño de la máscara y deben seleccionarse para que los electrodos de grabación abarcan las regiones cerebrales de interés como se inyecta a lo largo de su estereotáctica trayectoria. Posición de la cámara (Figura 6B) para mostrar la parte superior de la sonda electrónica de malla dentro de la aguja de vidrio. Un software permite al usuario dibujar una línea en la pantalla para marcar la posición original de la malla electrónica. Iniciar el flujo de la bomba de jeringa a una velocidad baja y oprimir Start. 10 mL/h es un caudal típico de partida una 400 μm de aguja capilar de diámetro interior. Poco a poco aumentar la velocidad de flujo si no se mueve la sonda electrónica de malla dentro de la aguja.Nota: Es importante minimizar el volumen de líquido inyectado en el cerebro ya que puede dañar el tejido que rodea el sitio de inyección. Los mejores resultados se logran con volúmenes de inyección menos de 25 μl por 1 mm de longitud de malla inyectado. Valores ideales son menos de la mitad de este volumen; en nuestro laboratorio, se inyecta típicamente 10-50 μL por una longitud de malla de 4 mm inyectado. La sonda de malla electrónica empieza a desplazarse la aguja, utilice la estereotáctica para retraer la aguja en la misma proporción con que se se inyecta la sonda electrónica de malla usando la posición original marcada de la malla electrónica como guía.Nota: Este procedimiento, denominado el método de inyección de campo de visión (FoV) de25, permite precisa entrega de malla electrónica a una región específica del cerebro sin arrugándose o dislocación. A menudo el caudal puede reducirse una vez que la sonda electrónica de acoplamiento comienza moverse dentro de la aguja. En nuestro laboratorio, caudales de 20 a 30 mL/h a menudo se requieren para superar la fricción estática entre la malla y aguja capilar paredes, pero la tasa entonces puede reducirse a 10 mL/h una vez que se ha iniciado el proceso de inyección. Caudales y volúmenes de inyección son generalmente más pequeños para agujas capilar de menor diámetro. Siguen fluyendo salina y retrayendo la aguja hasta que la aguja ha salido de la calavera. Detener el flujo de la bomba de jeringa. 4. interfaces de entrada/salida de Nota: en este punto, la sonda electrónica de malla se ha inyectado desde el punto de partida deseado dentro del cerebro a lo largo de la trayectoria solicitada. La aguja ha sido retraída y es justo por encima de la craneotomía con la malla de interconexiones de electrónica que abarca desde el cerebro hasta la aguja y la entrada-salida pastillas dentro de la aguja (figura 7B). Esta sección utiliza una placa de circuito impreso (PWB; Figura 7, figura 8) para la interfaz a la sonda electrónica de malla. El PCB conecta un conector ZIF a un conector de amplificador estándar 32 canales a través de un sustrato aislante que se convierte en el escenario de cabeza para los experimentos de grabación neural. El PCB es personalizable para adaptarse a diversas configuraciones de etapa de cabeza. Nuestros archivos de diseño están disponibles por solicitud o desde el sitio web de recursos, meshelectronics.org y puede usarse para comprar PCB bajo costo de los proveedores de servicios de fabricación y montaje de PCB. Utilizar el marco estereotáctica para guiar cuidadosamente la aguja a la FFC sustrato de fijación y a través de la brecha, que fluye la solución con la bomba de jeringa para generar tensión en la malla electrónica interconecta (figura 7). Una vez que la aguja está sobre el sustrato de fijación y a través de la brecha, reanudar el flujo a un ritmo rápido para expulsar la malla electrónica cojines I/O sobre el substrato de fijación (figura 7). Usando unas pinzas y una pipeta de DI, se doblan los cojines I/O a aprox. ángulo de 90° como cerca de la primera tecla de I/O posible.Nota: La flexión es necesaria dejar las pastillas ser insertado en el conector ZIF en un PCB en un paso posterior. El conector ZIF es exactamente la misma anchura como las 32 teclas de I/O de la sonda electrónica de malla, un imperfecto 90° curva, o una curva que no está ocurriendo justo antes de la primera tecla I/O, dará lugar a tener que cortar las almohadillas I/O (las teclas de izquierda en la figura 7E). Una vez que las pastillas de I/O están alineadas, revelado y en un ángulo de 90° a la espiga de acoplamiento, seco en lugar con suavemente que fluye aire comprimen.Nota: Se interfaza a malla electrónica sondas con menos de 32 canales con la misma tarjeta de interfaz de 32 canales. Por ejemplo, nuestro laboratorio utiliza comúnmente malla 16 canales electrónica sondas con PCB de 32 canales. Esto proporciona un espacio extra en el conector ZIF, facilitando la interconexión y los canales aislados adicionales son fácilmente identificables como circuitos abiertos por medio de impedancia pruebas durante las sesiones de grabación. Corte del sustrato de fijación con abrazadera en un borde recto aproximadamente 0,5 – 1 mm del borde de las pastillas de I/O. También cortar partes extrañas del sustrato de fijación que le dificultan la inserción en el PCB montado 32 canales ZIF conector (figura 7F). Inserte las almohadillas de I/O en el conector ZIF en la placa y cierre el pestillo (figura 7). Interfaces de electrónica de medición de uso para medir la impedancia entre los canales y el tornillo de tierra para confirmar éxito. Si los valores de impedancia son demasiado altos, suelte el conector ZIF, ajustar la inserción y volver a probar hasta que se confirme la conexión exitosa. Cubra el conector ZIF y malla expuesta electrónica interconecta con cemento dental para protección. Flip el PCB en el boquete en el sustrato y fijar el PCB con cemento sobre el cráneo de ratón (figura 7 H).Nota: El FFC en el boquete de flexión reduce la tensión mecánica que a veces puede romper la malla de interconexiones de electrónica. Permita que el cemento fragüe, convirtiendo el PCB en una robusta y compactada-etapa para conectarse durante las sesiones de grabación posterior (figura 7I). 5. nervios grabación experimentos Coloque el ratón en un tailveiner u otro limitador33. Inserte el preamplificador PCB en el conector estándar amplificador en la placa de etapa de cabeza. Utilice un cable separado para el tornillo de la referencia de tierra. Para grabaciones refrenadas, deje el ratón en el limitador. Registro de datos utilizando el sistema de adquisición de datos para el período de tiempo deseado (figura 8A). Para mover libremente las grabaciones, suelte el ratón desde el limitador después de insertar el preamplificador PCB y el tornillo de referencia de puesta a tierra. Récord para la longitud deseada de tiempo utilizando el sistema de adquisición de datos mientras que el ratón se comporta libremente (figura 8B). Al final de la sesión de grabación, ponga el ratón en el limitador, si es necesario. Retire el cable de tierra y preamplificador, luego suelte el ratón de su jaula y volver al centro de animales hasta la siguiente sesión de grabación. 6. histológica de seccionamiento, tinción y la proyección de imagen Espere hasta después de la inyección de la hora deseada, luego anestesiar el ratón y transcardially perfusión con formaldehído. Retirar, congelación y criosección el cerebro en rodajas gruesas de 10 μm. Un protocolo detallado en inmunohistoquímica y cryosectioning de tejido cerebral de roedor puede encontrarse en Evilsizor, et al. 34.Nota: Tejido fino del cerebro que contienen malla electrónica puede ser fijo y seccionado normalmente, a pesar de la vigilancia electrónica se queda dentro. Se trata de una funcionalidad única en comparación con el convencionales neurales las puntas de prueba, que debe eliminarse antes del seccionamiento y por lo tanto, pueden modificar el tejido o hacer difícil analizar la interfaz sonda-tejido. Enjuague las secciones de tejido de cerebro congelado 3 veces en 1 x PBS. Bloquear las secciones en una solución de 0.3% Tritón X-100 y 5% de suero de cabra en PBS 1 x. Deje reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Incubar las secciones con la solución de anticuerpos primarios. Las soluciones de anticuerpo primario utilizadas aquí fueron rata anti-GFAP (dilución 1: 500) con 0.3% Tritón X-100 y 3% de suero de cabra, conejo anti-NeuN (dilución 1: 200) y Neurofilament anti ratón (dilución 1: 400). Incubar durante una noche a 4 ° C. Enjuague las secciones 9 veces para un total de 40 minutos con PBS 1 x. Incubar las secciones del cerebro con la solución de anticuerpos secundarios. Las soluciones de anticuerpo secundario utilizadas aquí fueron Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo (dilución 1: 200), Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón (dilución 1: 200) y Alexa Fluor 647 cabra anti-rata (dilución 1: 200). Incubar las secciones por 1 h a temperatura ambiente. Enjuague las secciones 9 veces para un total de 30 minutos con PBS 1 x. Monte las secciones sobre el portaobjetos con cubreobjetos usando mountant antifade. Dejo las diapositivas en la oscuridad durante al menos 24 h antes de la proyección de imagen. Las diapositivas de imágenes con un microscopio confocal con 488 nm, 561 nm y láseres de 633 nm como las fuentes de excitación para Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 y Alexa Fluor 647, respectivamente. Utilizar contraste de interferencia diferencial (DIC) para la malla electrónica de la imagen en el mismo microscopio para posterior superposición de las imágenes y el análisis.