注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理

脊椎動物について実行されるすべての手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ハーバード大学によって承認されました。 1. メッシュ エレクトロニクスの作製 注: このセクションで説明する手順は、センターのナノスケール システム (CNS)、ハーバード大学などの標準的な大学クリーン ルーム施設内で使用するものです。この施設に準ずる施設と同様の例として、一部の国家ナノテクノロジー インフラストラクチャ ネットワーク (NNIN) 国立科学財団 (NSF) によってサポートされているため、アメリカ合衆国の周りの外部ユーザーにアクセス可能です。これらの施設でツール、機器、およびこのセクションに記載されている材料の多くはクリーン ルーム施設へのアクセスと共に提供され、別途購入は必要ありません。 注意: メッシュの電子機器の製造に使用される化学物質の多くは有害、レジスト、CD 26、PG の除去、SU 8 開発者、および Ni エッチング液を含みます。使用する前にこれらの化学物質、材料安全性データ シート (MSDS) を参照してくださいと実装し、すべての回で適切な安全対策に従ってください。 熱蒸発 100 nm の Ni のきれいな Si ウエハ上に。注: 典型的な成膜パラメーターは、5 x 10-7 T の基本圧力と 1-2 Å/秒のレート。Ni の薄層は、ウェハからメッシュ電子を解放するを廃止後犠牲層として機能します。 最初に PL マスク (PL マスク 1) を使用すると、メッシュ エレクトロニクス SU 8 ネガ型フォトレジスト (図 2 a) の層を不動態化底を定義できます。注: PL は感光基板上開催マスクに当てると紫外線 (UV) で標準的な微細加工技術です。光いずれは不溶性 (否定的な抵抗) や水溶性 (ポジ形レジスト) 基板上の露出部分、なります。マスクがコンピューター支援設計 (CAD) ソフトウェアで描画され、通常、ベンダーから注文します。マスク ・ アライナは、マスク基板上の既存のパターンに合わせ、UV ライトにそれらを公開する使用されます。メッシュ製品の製作には、4 種類のマスク (PL PL マスク 4 をマスク-1) が必要です。私たちのマスク デザインが要求やリソース サイトから利用可能な meshelectronics.org。 400-500 nm のおおよその SU 8 厚さ 4,000 rpm でウェーハ上にスピンコート SU 8 2000.5年ネガ型フォトレジスト ソフト 95 ° C で 1 分続く 65 ° C で 1 分ホット プレートにウェーハを焼く PL マスク – 1 底メッシュ SU 8 層に対応する SU 8 を公開するマスクアにウェハをロードします。I 線 (365 nm) 線量 100 mJ/cm2で公開します。 ポストが 95 ° C で 1 分続く 65 ° C で 1 分ホット プレートにウェーハを焼く SU 8 開発者のトレイにウェーハを浸します。SU – 8 メッシュ パターンが完全に開発されているまで 2 分のためのソリューションが振ちましょう。イソプロピル アルコール、1 分およびブローのトレイにすすいでください。 ハード 180 ° C 1 時間でホット プレートにウェーハを焼きます。注: SU 8 は通常ハード 150 ° C と 250 ° C 以下の開発の間焼きです。ハード ディスク焼く焼鈍表面ひび機械的安定性を確保するため SU 8 の開発し、さらに架橋の中にフォームがあります。ハード 180 ° C 下 SU 8 層と上部の 190 ° C で焼成 SU 8 層メッシュ電子のため良い結果が得られます。 金属を定義する使用 PL マスク 2 相互接続と I/O パッド (図 2 b)。 300 のおおよその厚さの 4000 rpm でウェーハ上にスピン コート LOR3A nm。注: LOR3A は、後続のメタライズ処理中にアンダー カットする速度を抵抗 polydimethylglutarimide ベースです。 5 分間 180 ° C でホット プレートにウェーハを焼きます。 500 のおおよその厚さの 4000 rpm でスピン コート S1805 ポジ型フォトレジスト nm。 1 分の 115 ° C でホット プレートにウェーハを焼きます。 PL マスク – 2 金属に対応する S1805 の配線を公開し、I/O パッド マスクアにウェハをロードします。40 mJ/cm2の h ライン (405 nm) 線量で公開します。 CD 26 は現像のトレイにウェーハを浸します。振とうソリューション 1 分金属配線パターンまでされて完全に開発。1 分とブローの脱イオン水 (DI) のトレイにすすいでください。 熱蒸発 3 Cr の nm は続いて 80 Au の nm。注意: 最大で 5 × 10-7 T の基本圧力、1 Å/s の蒸着速度通常最高の映画品質になります。 金属が完全にアンダー カット、所望するインターコネクトとメッシュ エレクトロニクスの I/O パッド領域だけで金属を残してまで約 3 時間の除去の PG のフラット ビーカーにウェハを浸します。イソプロピル アルコールとブロードライにすすいでください。 PL マスク 3 を使用すると、Pt 電極 (図 2) を定義できます。 1.3.1 1.3.4 を介しての手順を繰り返します。 PL マスク – 3 Pt 電極に対応する、S1805 を公開するマスクアにウェハをロードします。40 mJ/cm2の h 線線量で公開します。 CD 26 は現像のトレイにウェーハを浸します。1 分のためのソリューションが振とうまで Pt 電極パターンが完全に開発されています。ディのトレイの 1 分とブロードライにすすぐ。 預金 3 電子ビームの蒸発器を使用して、Cr の nm は続いて 50 Pt の nm。注: 典型的な成膜パラメーターは 5 x 10-7 T の基本圧力及び率 2 Å/秒。 金属が完全にアンダー カット、メッシュ電子機器の適切な電極サイトでのみ Pt を残してまで約 3 時間の除去の PG のフラット ビーカーにウェハを浸します。イソプロピル アルコールとブロードライにすすいでください。 PL マスク-4 を使用して、メッシュ エレクトロニクス SU 8 ネガ型フォトレジスト (図 2 D) との層を不動態化トップを定義します。 PL マスク – 4 SU 8 のトップ保護メッシュ レイヤーに対応する公開を除く、1.2.5 を通じて 1.2.1 手順を繰り返します。 ハード 1 h 190 ° C のホット プレートにウェーハを焼きます。注: この温度は 10 ° C 下 SU 8 (ステップ 1.2.6) のハード ディスク焼くのよりも高い。この高温は若干下 SU 8、トップの SU 8 層をマージし、したがって単一、連続的な SU 8 構造を形成する原因とを再配置されます。 エレクトロニクスのメッシュは今完了 (図 2 eおよび図 3)Ni の犠牲層を溶解することにより Si 基板から外します。 50 W 1 分で酸素プラズマを用いたウェーハを扱います。これは SU 8 表面親水性、水溶液中で容易に中断するメッシュを許可を酸化させます。 フラット ビーカー 1:1 の体積比で塩酸、塩化第二鉄と DI を組み合わせる: 20 をそれぞれ Ni エッチング液の溶液を作成します。 メッシュ電子が Si ウェハから完全に解放されるまで約 3 時間ニッケル エッチング液のフラット ビーカーにウェハを浸します。 Ni エッチング液から DI の 100 mL のビーカーに電子プローブにリリースされたメッシュを転送するのにパスツール ピペットを使用します。洗浄できるように少なくとも 3 倍ディの新鮮なビーカーにメッシュ エレクトロニクスを転送します。 パスツール ピペットを使用してメッシュのエレクトロニクスを消毒用、70/30% エタノール/水ソリューションに転送し、ピペットを使用してメッシュの電子機器を滅菌水の洗浄効果に転送します。注: 滅菌後メッシュ エレクトロニクスは高機能化、他のソリューションに転送できます。たとえば、24 時間のポリ D リジン (1 mg/mL) の水溶液に、細胞接着を促進するメッシュ エレクトロニクスを転送できます。 メッシュ エレクトロニクスを転送するパスツール ピペット滅菌 1 x リン酸の 100 mL のビーカーにプローブの使用は、インジェクションで生体の前に生理食塩水 (PBS) をバッファーしました。 2. 針にメッシュ エレクトロニクスの読み込み ピペット ホルダーの購入として、両端で流れるようです。注入 (図 4 a) の間に漏れがないように、エポキシ、円形ねじファスナーの反対側をシールします。続行する前に硬化エポキシをしましょう。 ピペット ホルダーにガラスの毛管の針を挿入します。円形の締め付けネジと円錐ワッシャー (図 4 b) を使用して場所に固定します。400 μ m 内径 (650 μ m 外径) ガラス キャピラリーの針は、このプロトコルに使用されました。他細針材料 (e.g。、金属) と直径が使用できますが、メッシュ電子の injectability を確保するための設計を変更する必要があります。注: 1.17 mm 内径 (250 μ m 1.5 mm 外径から) 150 μ m に至る毛細血管針は、当研究室で使用されています。小さいサイズの針で注入を横と縦 SU 8 メッシュ要素より急性間交差の角度を作る、SU 8 メッシュ要素の幅を小さく、薄く SU-8、し、粗い使用によって昇格できます (すなわち、。大きい単位の細胞) メッシュ構造。メッシュの小さい毛細血管針が要求やリソース サイトから利用可能なために設計されたフォトマスク meshelectronics.org。400 μ m の内径と外径 550 μ m ガラス キャピラリー針は商業的ご利用頂けます。これらは 400 μ m の内径を必要とするメッシュとの互換性を維持するが、ここで説明した研究のために使用しない注入によって引き起こされる急性組織損傷を減少させます。 キャピラリー チューブの 2-4 cm の長さを使用してピペット ホルダー側出口に 1 mL 注射器を接続します。 メッシュ エレクトロニクスを含む PBS の 100 mL のビーカーにガラスの毛管針を挿入します。電子プローブし、針 (図 5および補足のビデオ 1) にメッシュ電子プローブを描画するため注射器を手動で撤回メッシュの I/O パッドの近くの針の先端を位置します。注: I/O パッド幹配線領域とメッシュ デバイス領域は簡単に肉眼で識別メッシュ電子プローブがソリューション内で利用停止。これにより、正しい方向で針にメッシュ エレクトロニクスの明確なロード。 プッシュ/プル メッシュ電子針内での位置を調整するシリンジのプランジャーはまだ生理食塩水に浸漬しながら。注: 理想的な位置決め可能な針の終わり近くとしてウルトラフレキシブル メッシュ デバイス領域です。この構成では、デバイスの領域は最初に注入される保証および I/O パッド中最後脳に注入される液体の量を最小限に抑えます。 ピペット ホルダー側出口からキャピラリー チューブを慎重にデタッチします。針内メッシュ電子の位置を変えることができる吸引力の作成を避けるためにゆっくりとそれをデタッチします。 3 メッシュ エレクトロニクスのライブ マウス脳注入脳定位固定装置 注: マウス 75 mg/kg ・ 1 mg/kg とケタミン dexdomitor の混合物の腹腔内注射で麻酔をかけられました。麻酔の程度は手術を開始する前につま先ピンチ メソッドで検証されました。体温は、麻酔中の 37 ° C の恒温毛布にマウスを置くことによって維持されました。外科を 1 時間使用する前にすべての金属製の手術器具をオートクレーブに限定されないなど、滅菌手袋を使用して、手術、滅菌フィールドのメンテナンス中ホット ビーズ滅菌器を使用しての適切な無菌手技が実装されましたdepilated 頭皮、70% エタノールで、プラスチック製の楽器の消毒手術部位周辺皮膚は切開する前に iodophor で準備中。サバイバル手術、手術の結論の後の傷の周り antiobiotic 軟膏を適用し、マウスが 37 ° C の加熱パッド装備ケージに返されました。彼らは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまでマウスが放置しません。マウスは、術後 72 時間まで 0.05 mg/kg 12 時間間隔の用量で腹腔内投与によるブプレノルフィン鎮痛を与えられました。マウスは、術後他の動物から隔離されていた。270 mg/kg 体重の投与量でペントバルビ タールのいずれかの腹腔内投与や transcardial 血流を介してマウスを安楽死させ (ステップ 6.1 を参照してください)。捜査官がガイガーらを参照してください。30、星のカービィ、ら31日、ゲージ、ら。32齧歯類定位手術の詳細については。 マウスの麻酔、脳定位固定装置のフレームの修正します。 麻酔中の乾燥を防ぐためのマウスの目に眼の潤滑剤を適用します。 歯科用ドリルや脳定位固定装置のフレームを使用して、頭蓋骨に目的の座標で開頭術を開きます。ステンレス製接地ネジやワイヤーの挿入の注射部位から 2 番目に開頭術を開きます。 頭蓋骨に締め金で止める基板を歯科用セメントで固定します。後の手順で折り畳み式のステップの信頼性を改善するために基板の約 1 mm ワイド ギャップをカットします。注: 多くの材料は、32 チャンネルの適切な厚さ (0.18 ± 0.05 mm 厚みケーブルの設計) ゼロ挿入力 (ZIF) コネクタである限り働くだろうが、フレキシブル フラット ケーブル (FFC) は”L”図形作品よく (図 7 a) にカット。 (図 4および図 6 a) 直角終了クランプを使用して固定フレームにメッシュのエレクトロニクスを含む針ピペット ホルダーをマウントします。 ピペット ホルダーの側コンセントを付ける 5 mL 注射器シリンジ ポンプ (図 6) を使用して固定、約 0.5-1 m キャピラリー チューブの長さ。メモ: は、ピペット ホルダーに接続する前にキャピラリー チューブ内に気泡がないことを確認します。泡は射出時の流れを中断し、メッシュ エレクトロニクスの滑らかな、管理された配信を阻止できます。 脳の中で希望する開始位置で針の先端の位置に定位のフレームを使用します。注: ここで使用されるメッシュ電子プローブは記録電極の長さに広がっています 2 mm と第 1 の電極が位置するメッシュ エレクトロニクス (図 3 aで一番左エッジ) の開始端から 0.5 mm。そのため、開始位置が 0.5 mm 興味の脳の領域よりも深くに定位座標を選択してください。普及とメッシュ エレクトロニクス内記録電極の位置マスク デザイン プロセス中に自由に選択することができます、ので、記録電極にまたがる関心の脳領域の脳定位固定装置に沿って注入されるように選択します。軌道。 ガラス針でメッシュ電子プローブのトップを表示する (図 6 b) カメラを配置します。いくつかのソフトウェアでは、メッシュの電子工学の元の位置をマークする画面に線を描画することができます。 ・ シリンジ ポンプを低速に設定してスタートを押すと流れを開始します。10 mL/h は 400 μ m の内径キャピラリー針の典型的な開始流量です。ゆっくりと針内メッシュ電子プローブが移動しない場合に流量を増やします。注: これは注射部位の周囲組織を損傷することが、脳に注入液量を最小限に抑えることが重要です。注入量で最高の結果を実現未満 25 μ L 注入されたメッシュの長さ 1 mm あたり。理想的な値は、このボリュームの半分以下本研究室では、通常注入 4 mm メッシュの長さあたり 10-50 μ L を注入します。 メッシュ電子プローブ針内を移動し始めると、脳定位固定装置のフレームを使用、メッシュ電子プローブ挿入される、メッシュ エレクトロニクスのマークの元の位置を参考にして同じ速度で針を撤回します。注: この手順、視野 (FoV) 注入法25と呼ばれる対象脳領域にメッシュ エレクトロニクスの正確な配信くしゃくしゃまたは転位せずできます。多くの場合メッシュ電子プローブ針内での移動が開始されると、流量を削減できます。本研究室では、20-30 mL/h の流量がメッシュとキャピラリー針壁の静的な摩擦を克服する必要がありますが、率を低減できる 10 mL/h にインジェクションのプロセスが開始されると。流量や注入量、通常小さい直径細針の小さいです。 生理食塩水に流れると針が頭蓋骨を終了するまで針の取り消しを続けます。シリンジ ポンプからの流れを停止します。 4. 入出力インタ フェース 注: この時点で、メッシュ電子プローブが挿入された選択した軌道に沿って脳内で開始位置から。針は、格納されているし、は電子配線メッシュと開頭のすぐ上脳からにまたがる針と I/O パッド (図 7 b) 針の中でも。このセクションを使用して、プリント回路基板 (PCB;図 7図 8) メッシュ電子プローブへのインタ フェースします。PCB は、神経細胞記録実験用ヘッド ステージとなる絶縁基板による 32 ch 標準アンプ コネクタ接続に ZIF コネクタを接続します。PCB はさまざまな頭ステージ構成に合わせてカスタマイズできます。要求やリソースのウェブサイト、meshelectronics.org、およびすることができますから私たちのデザイン ファイルがありますプリント基板製造・組立サービスのベンダーから Pcb を安く購入するために使用します。 慎重に基板をクランプ FFC に針を誘導する脳定位固定装置のフレームを使用し、ギャップを渡って (図 7) を配線メッシュ エレクトロニクスでたるみを生成するシリンジ ポンプのソリューションを流れます。 針がクランプの基板上とギャップを渡って、メッシュ エレクトロニクス (図 7) のクランプの基板上に I/O パッドを取り出すに速い速度でフローを再開します。 I/O パッドとして、できるだけ最初の I/O パッドに近い約 90 ° 角度に曲げるピンセットとディのピペットを使用する。注: は、後続の手順で基板の ZIF コネクタに挿入するパッドを許可するため、曲げ加工です。ZIF コネクタは 32 I/O パッド メッシュ電子プローブの不完全な 90 ° ベンドは、または最初の I/O パッドの前に発生していないベンド、I/O パッド (図 7 eで一番左のパッド) を切断することになります、同じ幅であります。 展開とドライ メッシュ茎に 90 ° の角度での I/O パッドが整列して、一度は穏やかに流れる場所で、空気を圧縮しました。注: メッシュ電子プローブ未満 32 チャンネルは、同じ 32 チャネル ・ インタ フェース ボードに接続することもできます。たとえば、私たちの研究室は一般 32 チャンネル基板を使って電子プローブ 16 チャネル メッシュを使用します。インタ フェースが容易、ZIF コネクタ内の余分なスペースと接触していないチャンネルを追加をインピー ダンス セッション、記録中にテスト オープン回路として容易に識別できます。 I/O パッドの端から mm ストレート エッジ約 0.5-1 でクランプの基板をカットします。また、PCB マウント 32 ch ZIF コネクタ (図 7 階) 挿入の妨げになるクランプ基板の余分な部分をカットします。 PCB の ZIF コネクタに I/O パッドを挿入し、ラッチ (図 7) を閉じます。使用測定電子チャネルと成功を確認する接地ネジ間のインピー ダンスを測定するためのインタ フェース。インピー ダンス値が高すぎるなら、ZIF コネクタのラッチを解除、挿入を調整し、正常に接続が確認できるまで再テストします。 公開されているメッシュ電子配線保護のため歯科用セメントと ZIF コネクタをカバーします。基板のギャップで基板を反転し、マウス頭蓋骨 (図 7 H) にセメントを用いた PCB を修正します。注: ギャップで FFC を曲げ電子配線メッシュを破ることができる時々 機械的ひずみを低減します。 堅牢でコンパクトなヘッド-ステージ以降の記録セッション (図 7I) 中にインタ フェース用に PCB を回す、硬化するセメントを許可します。 5. 神経細胞記録実験 Tailveiner またはその他の落33にマウスを配置します。プリアンプ基板を頭段基板の標準アンプ コネクタに挿入します。参考ねじを地面に別のケーブルを使用します。 拘束された録音のため、落にマウスを移動します。目的の期間 (図 8 a) のデータ集録システムを使用してデータを記録します。 録音を自由に移動するためには、プリアンプ基板を挿入して、接地基準ネジの後、落からマウスボタンを放します。マウスが自由に行動しながら、データ集録システムを使用しての時間 (図 8 b) の希望の長さの記録。 記録セッションの終わりには、必要に応じて、落にマウスを置きます。アースを外し、プリアンプは、そのケージに戻ってマウスのボタンをし次の記録セッションまで動物施設にそれを返します。 6. 組織断面、染色、およびイメージ投射 投与後希望の時間まで待って、マウスを麻酔し、transcardially をホルムアルデヒドと灌流します。削除、凍結、および cryosection 10 μ m の厚さのスライスに脳。免疫組織化学および齧歯動物の脳組織のセクショニングの詳しいプロトコルは、Evilsizor で見つけることができますら。34。注: メッシュ エレクトロニクスを含む脳組織が固定し、監視電子が内部に残っていても通常、断面します。これは区分する前に削除する必要がありますしたがって可能性があります変更組織やプローブ組織インターフェイスを分析することは困難は、従来神経プローブと比較してユニークな機能です。 1x PBS で 3 回冷凍脳切片をすすいでください。 1x PBS で 0.3% トリトン X-100 と 5% ヤギ血清のソリューションのセクションをブロックします。室温で 1 時間に座ってみましょう。 一次抗体の解決セクションを孵化させなさい。ウサギ抗 NeuN (希釈 1: 200)、マウス抗ニューロ フィラメント (1: 400 希釈)、0.3% トリトン X-100 と 3% ヤギ血清とラット抗 GFAP (1: 500 希釈) され、ここで使用される一次抗体ソリューション。4 ° C で一晩インキュベートします。 1x PBS で 40 分の合計のための 9 回のセクションをすすいでください。 二次抗体の溶液で脳のセクションを孵化させなさい。Alexa Fluor 488 ヤギ抗うさぎ (希釈 1: 200)、Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス (1: 200 希釈)、Alexa Fluor 647 ヤギ抗ラット (希釈 1: 200) され、ここで使用される二次抗体ソリューション。室温で 1 時間セクションを孵化させなさい。 1x PBS で 30 分の合計のための 9 回のセクションをすすいでください。 Coverslips antifade フィルターとフィルターを使用してスライド ガラスのセクションをマウントします。イメージングの前に少なくとも 24 時間暗闇の中でスライドを残します。 488 を用いた共焦点顕微鏡でスライドを画像 nm、561 nm と Alexa Fluor 488 の励起源として 633 nm のレーザー、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 647、それぞれ。後続オーバーレイ画像と解析のための同じ顕微鏡画像メッシュ エレクトロニクスに差動干渉の対照 (DIC) を使用します。