استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لاستخراج الحمض النووي الفيروس سريعاً من الدم كله فيروس معطل. الاستخراج تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء. الأسلوب لا تعتمد على مرافق المختبرات، ويمكن استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية).
Abstract
التشخيص السريع للعدوى أمر أساسي لإدارة تفشي واحتواء المخاطر، والعناية بالمرضى. أننا أظهرنا سابقا طريقة للمنظمة السرير السريع لفيروس الإيبولا أثناء أخذ عينات من الدم لإجراء اختبارات الحمض النووي آمنة (غ) عن طريق إضافة المخزن مؤقت تحلل تجارية/ربط مباشرة إلى أنابيب جمع الدم فراغ. باستخدام هذا النهج المنظمة السرير، وقد وضعنا آمنة وسريعة ومبسطة سرير نا استخراج أسلوب للكشف عن الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة اللاحقة. استخراج نا تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء.
بعد أن يتم جمع الدم في المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، المحتويات مختلطة بقلب الأنبوب باليد، وهي المحتضنة الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الزجاج المغناطيسي الجسيمات (مجبس) هي إضافة إلى الأنبوب، والمحتويات مختلطة بالتقليب أنبوب جمع باليد. ثم يتم جمع مجبس جانب أنبوب جمع الدم باستخدام حامل مغناطيسي أو مغناطيس وشريط المطاطي. مجبس غسلها ثلاث مرات، وبعد إضافة شطف المخزن المؤقت مباشرة في أنبوب جمع، الناس مستعدون للاختبارات نا، مثل قبكر أو حلقة متحاور التضخيم (المصباح)، دون إزالة مجبس من رد فعل. طريقة استخراج نا لا يعتمد على أي مرافق المختبرات، ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية وأجنحة العزل في المستشفى). عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك محمولة، يمكن الحصول على تشخيص داخل 40 دقيقة لجمع الدم.
Introduction
في حالات تفشي الفيروس، عند المرضى الذين تقتصر على أجنحة العزل في المستشفى أو عندما يحتاج إلى تشخيص سريع، يتحتم تشخيص جزيئي نقطة من رعاية آمنة وبسيطة ودقيقة لاحتواء المريض الرعاية والمخاطر. تفشي الفيروسية الأخيرة اثنين، لفيروس الإيبولا (أبوف) في غرب أفريقيا (2013) وفيروس زكى في أمريكا الجنوبية (2015)، زاد الاهتمام بتحسين العناية بنقطة الجزيئية الاختبارات التشخيصية، مثل النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح)1،2 و recombinase بوليميريز التضخيم (الجيش الوطني الرواندي)3،4. RT-مصباح والجيش الوطني الرواندي هي الاختبارات الجزيئية السريعة والحساسة، والمحددة التي يمكن أن يؤديها على الاستعدادات نموذج مبسط. لهذا الفيروس زكى، الرايت-مصباح قد اقترن بتدفق أفقي مقايسة (الوكيل)، الذي يمكن الكشف عن الفيروس Zika في عينات غير تنقية الدم كله داخل 30 دقيقة1؛ ومع ذلك، أبوف، التي تصنف على أنها ممرض مجموعة 4 مخاطر وهو معد للغاية، العينات تحتاج إلى معالجة إطار السلامة الأحيائية من المستوى 4 (BSL-4) الشروط وغير نشط قبل إجراء أي إجراءات تشخيصية آمنة.
واستخدمت أساليب المنظمة مبسطة أبوف، مثل إضافة المخازن المؤقتة لتحلل عينة2،3،،من45، أثناء اندلاع؛ ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق التعامل مع ظروف BSL-4 مع معدات المختبرات، مثل خزانات السلامة البيولوجية BSL-3 وأجهزة الطرد المركزي، وكتل تدفئة والماصات، كحد أدنى. هذه المعدات عادة غير موجود في أجنحة العزل أو في مستشفيات ميدانية. للتغلب على هذا التحدي، بذلت محاولات إجراء عمليات التشخيص في حقائب3، وكان العديد من الأجهزة المحمولة والأجهزة المتقدمة [مثلجهاز محمول لاستخراج الحمض النووي (غ)]6. ومع ذلك، عينات أبوف الإيجابية لا تزال بحاجة ليكون غير نشط قبل أن يمكن استخدام هذه الأجهزة.
سابقا أبلغنا أسلوب المنظمة فيروس سرير سريع لفيروس اللقاحية، أبوف7و فيروس جدري بقر8 قبل إضافة المخزن المؤقت تحلل التجارية/ملزمة أنابيب جمع الدم فراغ العادية، مما يسمح للمباشرة نقل الدم من المريض إلى المخزن المؤقت للمنظمة7. هذه المنظمة مباشرة وفورية في نظام مغلق ويلغي الحاجة للتعامل مع العينات باستخدام أي احتواء صارمة، مثل شروط BSL-47، ويمكن التعامل مع العينات BSL-2 في الظروف العادية. هذا الأسلوب المنظمة متوافق مع عدة أنظمة استخراج نا، مثل الروبوتات واليد تنقية مجموعات7؛ ومع ذلك، هذه الأساليب تتطلب معدات المختبرات، مثل الروبوتات وأجهزة الطرد المركزي، والكهرباء، والتي لا تكون دائماً موجودة في إعدادات الحقل، أو داخل أجنحة العزل في المستشفى.
وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة ومبسطة يدوي نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية اللاحقة. طريقة استخراج نا لا يتطلب أي معدات خلاف حامل مغناطيس/مغناطيسية. لا توجد أجهزة الطرد المركزي، تدفئة كتل، أو الكهرباء اللازمة لاستخراج نا. ومن ثم، هذا الأسلوب لا يعتمد على مرافق المختبرات ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية، في أجنحة العزل في المستشفى، أو مع إعدادات الموارد المنخفضة). طريقة استخراج نا سريعة وبسيطة ويمكن استخدامها مباشرة في أي اختبارات نا المتلقين للمعلومات، مثل قبكر أو RT qPCR مصباح RT-مصباح. عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك متحاور يحركها البطارية محمولة، يمكن الحصول على تشخيص سرير داخل 40 دقيقة لجمع الدم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة وبسيطة دليل سرير نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية المتلقين للمعلومات. ووضعت طريقة استخراج نا وصف المراد تنفيذها مباشرة على عينات الدم كله في أنابيب جمع الدم الفراغ الذي يحتوي على المخزن المؤقت (ج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر سوزان لوبيز راسموسن وجنسن سولفيج Kolbjørn الخاصة بالمساعدة التقنية ومعالجة العينات السريرية. هذا المشروع هو جزء من مجموعة ابولامودراد، التي تلقت تمويلاً من “مبتكرة الطب المبادرة 2 مشترك التعهد” تحت منحة اتفاق N ° 115843. هذا “التعهد المشترك” يتلقى الدعم من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث وبرنامج الابتكار وافبيا.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
