Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total
Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’extraction des acides nucléiques virus rapide de virus inactivés Germains. L’extraction est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité. La méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne).
Abstract
Le diagnostic rapide d’une infection est essentiel pour la gestion des épidémies, le confinement de risque et les soins aux patients. Nous avons déjà montré une méthode pour l’inactivation rapide chevet du virus Ebola lors des prélèvements sanguins pour les tests de sécurité d’acide nucléique (NA) en ajoutant un tampon de lyse/liaison commerciale directement dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide. Avec cette approche de chevet inactivation, nous avons développé une sûre, rapide et simplifiée chevet NA méthode d’extraction pour la détection ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. L’extraction de la NA est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité.
Après que le sang est prélevé dans le tampon de lyse/liaison, les contenus sont mélangés en retournant le tube à la main, et le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante. Particules de verre magnétique (POP) sont ajoutés au tube, et le contenu est mélangé en retournant le tube de prélèvement à la main. Pop est ensuite recueillies sur le côté du tube de prélèvement à l’aide d’un support magnétique ou un aimant et un élastique. Les pop est lavées trois fois, et après l’addition de tampon d’élution, directement dans le tube de prélèvement, le NAs sont prêt pour les tests de NA, comme qPCR ou amplification isotherme boucle (lampe), sans l’élimination des pop de la réaction. La méthode d’extraction de NA ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans les hôpitaux de campagne et les salles d’hôpital isolement). Lorsque cette méthode d’extraction de NA est combinée avec lampe et un instrument portatif, un diagnostic peut être obtenu au sein de 40 min de la collecte de sang.
Introduction
En cas d’épidémie de virus, lorsque les patients sont confinés à l’hôpital d’isolement ou lorsqu’un diagnostic rapide est nécessaire, un diagnostic moléculaire précis, simple et sûr de point-of-care est impératif pour le confinement des soins et risque patient. Les deux récentes éclosions virales, du virus Ebola (EBOV) en Afrique de l’Ouest (2013) et le virus Zika en Amérique du Sud (2015), ont augmenté l’intérêt pour l’amélioration point-of-care moléculaires tests diagnostiques, comme isotherme boucle-négociée de transcription inverse amplification (RT-lampe)1,2 et recombinase polymérase amplification (RPA)3,4. RT-lampe tant l’APR sont des tests moléculaires rapides, sensibles et spécifiques qui peuvent être effectuées sur les préparatifs de l’exemple simplifié. Pour le virus Zika, RT-lampe a été combinée avec un essai d’écoulement latéral (LFA), qui peut détecter des virus Zika dans des échantillons de sang total non épurées dans 30 min1; Toutefois, pour EBOV, qui est classé comme un pathogène de groupe 4 risque et est extrêmement contagieuse, les échantillons doivent être gérées en vertu de la biosécurité de niveau 4 (BSL-4) les conditions et inactivés avant toute procédure de diagnostic sûr puisse être exécutée.
Méthodes d’inactivation simplifiée pour EBOV, telles que l’ajout de tampons de la lyse de l’échantillon2,3,4,5, ont été utilisés lors de l’épidémie ; Cependant, ces méthodes nécessitent un traitement dans des conditions de BSL-4 avec matériel de laboratoire, tels que BSL-3 armoires de biosécurité, centrifugeuses, blocs de chauffage et pipettes, au minimum. Cet équipement n’est pas normalement présent dans les quartiers d’isolement ou dans des hôpitaux de campagne. Pour relever ce défi, a tenté d’effectuer des diagnostics de valises3et plusieurs appareils portables et les machines ont été développées [par exemple, un appareil portatif pour l’extraction des acides nucléiques (NA)]6. Toutefois, les échantillons positifs EBOV encore besoin être inactif avant que ces dispositifs peuvent être utilisés.
Nous avons déjà rapporté une méthode d’inactivation des virus chevet rapide pour le EBOV7, virus de la vaccine et Cowpox virus8 par addition d’un tampon de lyse/liaison commerciale pour les tubes de prélèvement sanguin sous vide ordinaire, permettant le direct transfert de sang du patient dans l’inactivation tampon7. Cette inactivation directe et immédiate dans un système fermé élimine le besoin de manipuler les échantillons à l’aide de n’importe quel un confinement rigoureux, tels que BSL-4 conditions7, et les échantillons peuvent être traités dans des conditions normales de BSL-2. Cette méthode d’inactivation est compatible avec plusieurs systèmes d’extraction de la NA, tels que les robots et main purification kits7; Cependant, ces méthodes nécessitent des équipements de laboratoire, tels que les robots, centrifugeuses et l’électricité, qui ne sont pas toujours présents sur le terrain ou à l’intérieur de l’hôpital d’isolement.
Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simplifiée NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction de NA ne nécessite pas un équipement autre qu’un magnet/Magnet holder. Aucun centrifugeuses, blocs, ou électricité de chauffage ne sont nécessaires pour l’extraction de NA. Par conséquent, cette méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne, dans les salles d’hôpital d’isolement, ou avec faibles ressources). La méthode d’extraction de NA est rapide et simple et peut être utilisée directement dans les tests de NA en aval, comme qPCR, RT-qPCR, lampe ou RT-lampe. Cette méthode d’extraction de NA est associé à la lampe et un instrument portable isotherme axée sur la batterie, un chevet diagnostic puisse être obtenu dans 40 min de la collecte de sang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simple chevet NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire en aval d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction NA décrite a été développée pour être effectuée directement sur des échantillons de sang prélevés dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide contenant la lyse/fixation tampon (Table des matières)7. Cet mémoire tampon spécifique in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Susanne Lopes Rasmussen et Solvej Kolbjørn Jensen pour leur assistance technique et pour manipuler les échantillons cliniques. Ce projet fait partie du consortium EbolaMoDRAD, qui a reçu un financement de l’innovants médecine Initiative 2 entreprise commune au titre de la subvention contrat N ° 115843. Cette entreprise commune bénéficie du soutien de la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’EFPIA et programme d’innovation.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
