JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Rat model van wijdverspreide cerebrale corticale demyelinatie geïnduceerd door een intracerebrale injectie van pro-inflammatoire cytokinen

Published: September 21, 2021
doi:
10.3791/57879
, , , , , ,
1Research Unit of Experimental Neurotraumatology, Department of Neurosurgery,Medical University Graz, 2Department of Neurology,Medical University Graz, 3Centre for Molecular Medicine, Department of Clinical Neuroscience,Karolinska Institutet, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics,Karolinska Institutet

Summary

Het hier gepresenteerde protocol maakt de reproductie mogelijk van een wijdverspreide demyelinatie van grijze stof van beide corticale hemisferen bij volwassen mannelijke Dark Agouti-ratten. De methode bestaat uit intracerebrale implantatie van een katheter, subklinische immunisatie tegen myeline oligodendrocyt glycoproteïne en intracerebrale injectie van een pro-inflammatoir cytokinemengsel via de geïmplanteerde katheter.

Abstract

Multiple sclerose (MS) is de meest voorkomende immuungemedieerde ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en leidt geleidelijk tot fysieke invaliditeit en de dood, veroorzaakt door wittestoflaesies in het ruggenmerg en cerebellum, evenals door demyelinatie in grijze stof. Hoewel conventionele modellen van experimentele allergische encefalomyelitis geschikt zijn voor het onderzoek van de celgemedieerde ontsteking in de spinale en cerebellaire witte stof, pakken ze geen pathologieën van grijze stof aan. Hier presenteren we het experimentele protocol voor een nieuw rattenmodel van corticale demyelinatie dat het mogelijk maakt om de pathologische en moleculaire mechanismen te onderzoeken die leiden tot corticale laesies. De demyelinisatie wordt geïnduceerd door een immunisatie met lage dosis myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) in een onvolledig Freund’s adjuvans gevolgd door een kathetergemedieerde intracerebrale toediening van pro-inflammatoire cytokinen. De katheter maakt bovendien meerdere rondes van demyelinatie mogelijk zonder injectie-geïnduceerd trauma te veroorzaken, evenals de intracerebrale levering van potentiële therapeutische geneesmiddelen die een preklinisch onderzoek ondergaan. De methode is ook ethisch gunstig omdat dierenpijn en angst of handicap worden gecontroleerd en relatief minimaal zijn. Het verwachte tijdsbestek voor de implementatie van het hele protocol is ongeveer 8 – 10 weken.

Introduction

MS is een immuungemedieerde, inflammatoire ziekte van het CZS, die voornamelijk myelineplaten beschadigt, maar uiteindelijk leidt tot het axonale verlies en permanente neuronale schade. MS is de meest voorkomende immuungemedieerde ziekte van het CZS met een geschatte prevalentie van ongeveer 2,3 miljoen mensen wereldwijd, volgens de National MS Society1, en vormt een grote persoonlijke en sociaaleconomische last. De gemiddelde leeftijd van het begin van de ziekte is 30 jaar en leidt tot het verlies van productieve jaren door het veroorzaken van ernstige invaliditeit. MS is momenteel ongeneeslijk en de huidige behandelingsmodaliteiten zijn erop gericht de symptomen tijdens een acute terugval bij relapsing-remitting MS te beheersen en het verloop van de ziekte te wijzigen om de terugvalfrequentie te verminderen door immunomodulerende therapie2,3. Er is nog geen behandelingsoptie effectief gebleken voor de progressieve typen4, met uitzondering van een recente klinische studie met B-cel depleting therapie, waarvan werd aangetoond dat deze werkzaam was in een subgroep van primaire progressieve MS (PPMS) patiënten met actieve ontsteking5. Hoewel verschillende potentiële genetische6- en omgevingsrisicofactoren7 zijn geïdentificeerd, blijft de etiologie van MS echter onbekend.

MS wordt gekenmerkt door grote inflammatoire demyeliniserende plaques in en diffuse verwondingen aan de witte stof8,9. Focale laesies zijn geassocieerd met een uitgebreide T-cel gemedieerde aanval, oligodendrocyt vernietiging, reactieve astrogliose, en axonale degeneratie, wat leidt tot een motor neuron daling. Grijze stof demyelinatie en atrofie hebben erkenning gekregen als aanvullende histopathologische kenmerken van de ziekte9,10,11. Dit laatste is gesuggereerd om bij te dragen tot de neurologische disfunctie en cognitieve achteruitgang bij patiënten12,13. Er zijn drie patronen van corticale demyelinatie onderscheiden, namelijk i) leukocortical, aaneengesloten met de wittestoflaesies (34%), ii) klein, perivasculaire (16%), en iii) subpial (50%). In tegenstelling tot focale wittestoflaesies, is gemeld dat deze grijze stoflaesies een T-cel gemedieerde aanval missen en in plaats daarvan worden gekenmerkt door een verbeterde microgliale activering, apoptose en neuronaal verlies12.

Tot op heden was het niet mogelijk om menselijke MS in één diermodel samen te vatten, grotendeels vanwege de complexiteit van de ziekte. In plaats daarvan zijn verschillende MS-diermodellen ontwikkeld, die elk verschillende aspecten van ziektepathogenese en progressiesimuleren, 14,15. De huidige diermodellen bootsen drie verschillende ziekteprocessen na: i) focale inflammatoire laesies, ii) diffuse wittestofletsel en iii) diffuse grijzestofpathologie.

Dierstudies van MS witte stof plaques zijn meestal uitgevoerd in rodent encephalomyelitis (EAE) modellen. Proefdieren worden actief geïmmuniseerd met een emulsie die een myeline-antigeen bevat [meestal myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG)16,17, myeline basiseiwit (MBP)18, of proteolipid eiwit (PLP)19], samen met een volledig Freund’s adjuvans (CFA)20. De ziekte kan ook passief worden geïnduceerd door een adoptieve overdracht van myeline-specifieke T-cellen21. Het ziekteverloop is afhankelijk van de antigeen/muis stam combinatie die wordt gebruikt. MOG35-55 in C57BL/6 resulteert bijvoorbeeld in een monofasische chronische ziekte22, terwijl PLP139-151 bij Zwitserse Jim Lambert (SJL) muizen leidt tot een relapsing-remitting disease course23 op een genderspecifieke manier24. Rat MOG35-55, verder, induceert een encefalitogenic T-cel respons, terwijl menselijke MOG35-55 induceert B-cel-afhankelijke ontsteking in C57BL/6 muizen25. Verschillende EAE-modellen bieden een uitstekend hulpmiddel om celgemedieerde ontstekingen voornamelijk in het ruggenmerg en cerebellum te bestuderen, maar voorhersenenstructuren zoals de cortex, corpus callosum en subcorticale structuren blijven grotendeels gespaard26. Diffuse wittestofletsels noch demyelinatie van grijze stof worden bovendien adequaat gerepliceerd in EAE-modellen26,27. Corticale demyelinatie geassocieerd met actieve EAE-inductie is gemeld bij marmosets28,29 en bij bepaalde Lewis rat substammen , in het laatste geval toegeschreven aan de heersende combinaties van MHC-klasse I en klasse II isotypes en allelen30.

Het cuprizone model31 is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van diffuse witte stof demyelinisatie en grijze stof pathologie met een uitgebreide demyelinisatie van de corticale, sub-corticale32, en hippocampale33 regio’s, evenals het corpus callosum34 en de caudate putamen35. Cuprizone intoxicatie, die in principe resulteert in metabole stress-geïnduceerde apoptose van de oligodendrocyten, bootst enkele kenmerken na van de corticale demyelinerende laesies van MS-hersenen zoals een microgliaactivatie, astrogliose en een relatief gebrek aan infiltrerende perifere immuuncellen. Het gebrek aan neuronale apoptose en thalamische atrofie, evenals de volledige resolutie van demyelinatie met een robuuste remyelinatie waargenomen bij het stoppen van de voedingscuprizone-suppletie32, beperken echter het gebruik van de cuprizone-intoxicatie als een preklinisch MS-model. Toxische demyelinatie kan ook worden geïnduceerd door een focale injectie van lysolecithine of ethidiumbromide in de witte stofkanalen36,37, maar deze methoden worden zelden gebruikt. Toxische demyelinatiemodellen zijn bijzonder geschikt voor de analyse van de complexe mechanismen van remyelinatie, zoals de behoefte aan oligodendrocytvoorlopercellen en astrocyten38,39. Gedetailleerde informatie over EAE – en intoxicatiemodellen is te zien in twee recente beoordelingen15,40.

De cytokine-geïnduceerde demyelinatie werd aanvankelijk ontwikkeld om spinale witte stof laesies te bestuderen in EAE41. Later werd het aangepast om corticale grijze stofpathologieën bij MS te bestuderen. Dark Agouti (DA) of Lewis ratten worden voor het eerst geprimed door een subklinische immunisatie met MOG1-12542,43 of MOG1-11644 in een onvolledig Freund’s adjuvans (IFA). In tegenstelling tot klassieke EAE-modellen vertonen deze geprimeerde dieren geen klinische symptomen van focale inflammatoire laesies in het ruggenmerg. In plaats daarvan worden een ontstekingsreactie en demyelinatie in de hersenen vervolgens bereikt door een intracerebrale toediening van een pro-inflammatoir cytokinemengsel [tumornecrosefactor alfa (TNFα) en interferon gamma (IFNγ)] zodra de dieren een stabiele titer van anti-MOG-antilichamen in het bloed hebben bereikt.

Studies van Merkler et al. 42 en Gardner et al. 44 hebben de werkzaamheid bewezen van een subpiale corticale demyelinisatie inductie door een subklinische MOG immunisatie en een intracerebrale of subarachnoïdale cytokine injectie. De gerapporteerde duur van de demyelinatie was echter te kort door de tijd, waardoor een volledige remyelinatie in 14 dagen of minder te kortstondig was, waardoor het venster voor farmacologische interventietests werd beperkt. Beide modellen maken bovendien gebruik van een traumatische injectiemodus, die op zich een injectietrauma en een bloed-hersenbarrière (BBB) afbraak kan veroorzaken en dus kan leiden tot een ongecontroleerde rekrutering van ontstekingscellen in het parenchym. Beide studies toonden bovendien demyelinatie aan die beperkt is tot een beperkt gebied, in de ipsitalale cortex of in de nabijheid van de plaats van de cytokine-injectie.

Om deze beperkingen te overwinnen, implanteerden we een katheter in de rechter pariëtale cortex van DA-ratten, met de kathetertip net boven het corpus callosum. Om een volledig herstel van de BBB-integriteit mogelijk te maken, kregen de dieren een rustperiode van 2 weken na de katheterimplantatie. Vervolgens werden de ratten subklinisch geïmmuniseerd met 5 μg recombinant MOG1-125 in IFA. Na het bereiken van een stabiel anti-MOG-antilichaam titer na ongeveer 4 weken, werd 2 μL cytokinemengsel binnen 10 minuten via de katheter geïnjecteerd met behulp van een programmeerbare spuitpomp. Deze procedure leidde tot een wijdverspreide corticale demyelinatie van zowel de ipsi- als de contralaterale hersenhelften in 15 dagen, met een gedeeltelijke remyelinatie ongeveer 30 dagen na cytokine-injectie43. Meerdere demyelinatiefasen kunnen bovendien worden geïnduceerd door de herhaalde toediening van pro-inflammatoire cytokinen via de katheter, en globale hersenatrofie, een gemeenschappelijk kenmerk van progressieve MS-subtypes45, kan al na de tweede demyelinatiefase43worden geïnduceerd . Belangrijk is dat de geïmplanteerde katheter ook kan worden gebruikt om farmacologische interventies te testen.

Het hieronder beschreven protocol geeft een gedetailleerde uitleg van de experimentele stappen voor een reproduceerbare generatie van wijdverspreide corticale demyelinatie in beide hersenhelften van DA-ratten met behulp van een intracerebrale katheter.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (Oostenrijks ministerie van Wetenschap en Onderzoek); Licentienummer: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). De volwassen mannelijke DA-ratten (10 – 12 weken oud) werden gehuisvest in een 12/12 uur licht / donker cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. 1. MateriaalvoorbereidingOPMERKING: De operatie wordt uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten, inclusief de boren, worden gereinigd met een geschikt ontsmettingsmiddel voordat u begint. Bereid een verdovingsmengsel voor: 0,02 mg/ml fentanyl, 0,4 mg/ml midazolam en 0,2 mg/ml medetomidine (eindconcentraties in het mengsel).OPMERKING: Zie de betreffende sectie Discussie voor alternatieve anesthetica. Bereid een tegengifmengsel voor: 0,07 mg/ml flumazenil en 0,42 mg/ml atipamezol (eindconcentraties in het mengsel). Monteer de katheter en de katheterdop met de inlaat en de schroef. Snijd de katheter met een scalpel op een lengte van 2 mm (figuur 1).OPMERKING: Gebruik hiervoor geen schaar, omdat deze de cirkelvormige dwarsdoorsnede van de kathetertip knijpt en vervormt. 2. Chirurgische voorbereiding Verdoof de rat door een intraperitoneale (i.p.) toediening van het verdovingsmengsel (1,5 ml/kg lichaamsgewicht). Scheer de kop van de rat tussen de oren met behulp van het elektrische scheerapparaat. Plaats een homeothermische deken op het stereotactische frame voordat u het dier positioneert, om onderkoeling tijdens de operatie te voorkomen. Immobiliseer het hoofd van de rat in het stereotactische frame met behulp van de oorstangen en bijtplaat, zodat het hoofd horizontaal en stabiel is. Controleer de stabiliteit door druk uit te oefenen op de schedel met de vinger of tang.OPMERKING: Een losse fixatie en niet-horizontale positionering binnen het stereotactische frame kunnen een afwijking van de beoogde coördinaten veroorzaken. Breng smerende oogdruppels aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen. Bedek de ogen met een ondoorzichtig materiaal om blootstelling aan chirurgisch licht te voorkomen. Reinig het geschoren gebied door de toepassing van 70% ethanol en 10% povidon-jodiumcomplex af te wisselen.OPMERKING: Volg alle voorzorgsmaatregelen tijdens de operatie om infectie te voorkomen. De operatie wordt uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Als asepsis wordt gebroken, moet het verontreinigde materiaal worden vervangen. 3. Katheter implantatie Maak een longitudinale incisie van ongeveer 2 cm lengte in het midden van de hoofdhuid. Gebruik bulldog klemmen om de huid tegen de zijkanten af te houden. Zie figuur 2voor een overzicht van deze stappen. Verwijder het bloed met behulp van een applicator met katoenen punt. Verwijder het schedelperiosteum. Reinig het weefsel met de applicator met katoenen punt en stel het schedelbot bloot. Laat de schedel ongeveer 1 minuut drogen. Identificeer de anatomische oriëntatiepunten, Lambda, Bregma en mediale hechting. Als de boor op het stereotactische frame is geïnstalleerd, plaatst u de boortip bij de Bregma als uitgangspunt. Beweeg 2 mm posterieure van de Bregma en ~2,4 mm lateraal naar de mediale hechting. Boor op deze plaats een gat met een diameter van 0,5 mm voor de katheter. Blaas voorzichtig botstof weg.OPMERKING: Het is belangrijk dat de dura mater intact blijft tijdens het boren. Om dit te garanderen, 1) gebruik een boor die op het stereotactische frame kan worden geïnstalleerd, 2) inspecteer het gat vaak tijdens het boren en 3) boor in kleine stappen – als er te veel druk op de schedel wordt uitgeoefend, zal de boortip doorgaan en de hersenen beschadigen wanneer de schedel volledig is gepenetreerd. Boor nog 3 gaten (~ 1,3 mm in diameter) voor de ankerschroeven op enkele millimeters afstand van het eerste gat. Blaas het botstof voorzichtig weg.OPMERKING: Selecteer ankerschroeflocaties die voldoende ruimte bieden voor de kathetertop (~ 2 mm in diameter) en de ankerschroefbladen (~ 1 mm). Verwijder het botstof door irrigatie met ongeveer 1 – 2 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of fysiologische zoutoplossing met behulp van een spuit. Maak de schedel schoon. Draai de ankerschroeven 2 – 3 volledige omwentelingen vast.OPMERKING: De ankerschroeven zijn nodig om de opstelling te stabiliseren door het tandcement en daarmee de katheter op hun plaats te houden. Zorg er tijdens het vastdraaien van een ankerschroef voor dat deze niet gemakkelijk kan worden verwijderd door deze voorzichtig met een tang omhoog te tillen. Omdat de implantatie van de katheter zelf weefseltrauma veroorzaakt, zal extra duraletsel tijdens het boren naar of het aandraaien van de ankerschroeven leiden tot meerdere traumatische verwondingen en mogelijk de vergelijkbaarheid binnen een groep belemmeren. Draai eerst de ankerschroeven vast en plaats de katheter als laatste. Steek de katheter van 2 mm door het eerste gat, loodrecht op het schedeloppervlak. Terwijl u de katheter nog steeds vasthoudt, brengt u een beetje tandcement aan en laat u het polymeriseren met een korte (~ 5 s) blootstelling aan het tandheelkundige uithardingslicht om de katheter te stabiliseren, waardoor het gebruik van beide handen in de volgende stap mogelijk is.LET OP: Vermijd tijdens het werken met een tanduithardingslicht direct naar de punt te kijken of naar het licht dat door het toepassingsgebied wordt gereflecteerd, omdat de hoge intensiteit van dit licht netvliesschade kan veroorzaken. Gebruik de juiste veiligheidsbril. Breng meer tandcement aan rond de katheter, veranker de schroeven en verstevig het tandcement met het tandheelkundige uithardingslicht (~ 15 – 30 s). Bevestig de verharding van het cement met de punt van een tang. 4. Sluiting van de wond en antagonisatie van anesthesie Sluit de hoofdhuid met resorbeerbare hechtingen, voorste en achterste hechting aan de katheter.OPMERKING: Aangezien er aan het einde van de implantatie een hobbelige opstelling over de schedel zal zijn, moet u de wond sluiten. Het te veel optillen van de huid zal leiden tot ongemak voor het dier. Injecteer het tegengifmengsel subcutaan (1,5 ml/kg lichaamsgewicht) met een spuit van 1 ml met een naald van 26 G. Enrofloxacine (2,5%) toedienen via subcutane injectie (7,5 mg/kg lichaamsgewicht) voor profylactische antibioticabehandeling. Carprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg lichaamsgewicht) en buprenorfine (1,2 mg/kg) toedienen voor pijnverlichting door subcutane injectie. 5. Postoperatieve zorg en medicatie Breng het dier terug naar de gemodificeerde kooi en houd het 1 – 3 uur onder observatie, met een toepassing van infrarood licht om onderkoeling te voorkomen. Observeer en herpositioneer het dier constant om de 5 tot 10 minuten tot postoperatief herstel. Wees extra voorzichtig om constante blootstelling aan licht aan de ogen tot herstel te voorkomen. Herhaal toedieningen van enrofloxacine (7,5 mg/kg lichaamsgewicht) en carprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg lichaamsgewicht) door subcutane injecties de dag na de operatie. Buprenorfine is niet nodig om te worden vernieuwd, omdat de vorige behandeling effectief is gedurende 72 uur. 6. Bereiding van immunisatiemengsel (ten vroegste 14 dagen na katheterimplantatie) Opmerking: Plaats de spuiten op ijs tijdens de bereidingsprocedure. Sluit twee glazen spuiten met een luer-slottip van 10 ml aan op de korte armen van een 3-wegkraan en sluit de derde uitlaat met de lange arm. Zorg ervoor dat de aansluitingen veilig en lekvrij zijn: voeg ongeveer 4 ml steriel PBS toe aan de open spuit terwijl u zuiger 2 vasthoudt. Plaats zuiger 1 en duw beide zuigers heen en weer terwijl u controleert op lekkage. Als er geen lekkage optreedt, gooi dan de PBS weg en verwijder zuiger 1 opnieuw. Pipet 1 ml IFA en 50 μg rMOG1-125 samen en stel het mengsel in een geschikte buis in op een eindvolume van 2 ml met steriel PBS (pH 7,4).OPMERKING: Als gevolg van emulsieverliezen op de uiteinden of wanden van spuiten tijdens de bereiding, bereidt u een groter volume voor dan bedoeld voor de toediening. Het is ook praktischer om je voor te bereiden op meer dan 1 dier tegelijk. Plaats het verdunde IFA- en rMOG1-125-mengsel in de open spuit. Plaats de zuiger voorzichtig met behoud van een losse druk op de tegenoverliggende zuiger (figuur 3A). Emulgeer het entmateriaal door het van de ene spuit naar de andere te drijven door de zuigers heen en weer te duwen, totdat het wit en stroperig is (figuur 3B). Bevestig een Luer-slotspuit van 1 ml aan de open korte arm van de 3-wegkraan en vul deze met entmateriaal (figuur 3C). Verdeel alle entmateriaal over 1 ml spuiten. Hou het op ijs tot de injectie. Dien het mengsel toe op de dag van het preparaat. 7. Immunisatie Verdoof de rat met isofluoraan in een kamer (~ 2 min, gemengd met zuurstof 2 L/min) en zorg vervolgens voor anesthesie via een masker (gemengd met zuurstof 1,5 L/min). Injecteer 200 μL entmateriaal subcutaan aan de staartbasis met behulp van een naald van 21 G.OPMERKING: Dien de injectie langzaam toe omdat de oplossing stroperig is. 8. Bepaling van antilichaamtiters Trek ~200 μL bloed 4 weken na de immunisatie terug om de anti-MOG antilichaamtiters te bepalen. Bedek de putten van een 96-putplaat met MOG (5 μg/ml in PBS) en incubeer ze gedurende 1 uur bij 37 °C. Blokkeer de plaat met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de plaat met rattenserum (1:50) en standaard 2 uur bij 37 °C. Was de plaat 3x met 200 μL PBS/Polysorbaat 20. Incubeer de plaat met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-rat IgG secundair antilichaam (1:10.000). Was de plaat 3x met 200 μL PBS/Polysorbaat 20. Voeg 100 μL peroxidase substraatoplossing per put toe en incubeer deze gedurende 20 – 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Meet de optische dichtheid bij een golflengte van 405 nm en bereken de antilichaamtiter uit de optische dichtheid met behulp van een standaardcurve. 9. Intracerebrale Cytokine Injectie Stel de lengte van de connector canule (2 mm) in. (Zie figuur 4 voor de voorbereidingsstappen.) Vul een spuit van 1 ml met het cytokinemengsel (500 ng/μL TNF-alpha, 300 U/μL recombinant rat IFN-gamma in steriel PBS). Sluit de spuit aan op een connector canule. Vul de canule met het cytokinemengsel. Vermijd bubbels. Monteer de spuit op de programmeerbare spuitpomp en programmeer deze om 0,2 μL/min te injecteren(afbeelding 5A). Start de pomp en laat deze werken om een luchtbelvorming aan de punt van de canule te voorkomen.OPMERKING: Bij de injectiesnelheid moet rekening worden gehouden met de binnendiameter van de gebruikte specifieke spuit; daarbij moet de spuitdiameter worden geregistreerd tijdens het opzetten van de pomp. Verdoof de rat met isofluraan in een kamer (~ 2 min, gemengd met 2 L/ min zuurstof) en zorg vervolgens voor anesthesie door een masker (gemengd met 1,5 L / min zuurstof) (figuren 5B en 5C). Breng smerende oogdruppels aan, omdat het dier minstens 30 minuten wordt verdoofd. Verwijder de katheterdop met de inlaat. Steek de connector canule in de katheter en schroef deze vast en draai deze vast(figuren 5D en 5E).OPMERKING: Maak het niet te strak aan, omdat dit de bovenste punt van de katheter zal vernietigen. Laat de injectie 10 minuten doorgaan (het totale injectievolume is 2 μL). Stop de pomp. Laat de canule 20 minuten in de katheter zitten om het geïnjecteerde volume volledig te laten diffuus worden. Schroef de connector canule los en verwijder deze langzaam om een vacuümeffect te voorkomen. Bevestig de katheterdop opnieuw met de inlaat en schroef deze vast. Laat het dier herstellen van de anesthesie in een kooi.

Representative Results

Corticale demyelinisatie kan op verschillende tijdstippen worden beoordeeld na een cytokine-injectie door immunohistochistry voor proteolipide-eiwit (PLP) (figuur 6). Figuur 6A toont intacte PLP-immunoreactiviteit op dag 15 bij een door MOG geïmmuniseerd controledier dat alleen steriel PBS via de geïmplanteerde katheter ontving. Op dag 1 na de cytokine-injectie kon demyelinatie al worden gedetecteerd bij MOG-geprimeerde dieren, zij het alleen in de nabijheid van het katheteriseerde gebied (figuur 6B). De PLP-immunoreactiviteit blijft intact in de contralaterale cortex 1 dag na cytokine-injectie. Op dag 3 kon een geleidelijke toename van het verlies van de PLP-immunoreactiviteit, die zich verspreidt in de ipsilaterale cortex (figuur 6C), worden waargenomen. Contralaterale corticale demyelinatie kan ook worden gedetecteerd op dag 3(figuur 6D),maar het is eerder beperkt tot het gebied onder de ankerschroeven, mogelijk als gevolg van een laag debietgebied van interstitiële vloeistof veroorzaakt door de ankerschroeven43. De afwezigheid van een soortgelijke waarneming bij de pbs-geïnjecteerde controledieren sluit de mogelijkheid van trauma-geïnduceerde demyelinatie als gevolg van de ankerschroef uit. Tussen dag 9 – 15 beïnvloedt demyelinatie grote delen van de cortex van beide hemisferen (Figuren 6E, 6Fen 6G). Dit valt samen met een observatie van langzaam gedrag, maar zonder een statistisch significante afname van de motoriek in een rotarod test43. De corticale demyelinatie wordt tot 30 dagen na cytokine-injectie in beide hemisferen(figuren 6H en 6I)volgehouden met slechts een gedeeltelijke remyelinatie. Figuur 6J toont een kwantificering van PLP-verlies in de corticale grijze stof na de intracerebrale cytokine-injectie. Opgemerkt moet worden dat plp-immunoreactiviteit nog niet is beoordeeld na perioden langer dan 30 dagen; daardoor moet de onmiddellijke oplossing van remyelinatie, indien aanwezig, nog worden beoordeeld door verdere experimenten. Een tweede toediening van cytokinemengsel via de geïmplanteerde katheter 30 dagen na de eerste injectie resulteert in duidelijke hersenatrofie op dag 15 (figuur 7). Figuur 1: Voorbereiding van de katheter. (A en B) De geleidekanule en de dummy canule (katheterdop met inlaat) worden gemonteerd en geschroefd. (C) Vervolgens wordt de katheter met behulp van een scalpel tot 2 mm groot gesneden. De microscopische observatie toonde aan dat het gebruik van een schaar voor dat doel de cirkelvorm van de canulepunt vervormt en daardoor moet worden vermeden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Implantatie van de katheter. (A) De operatie begint met een longitudinale incisie en verwijdering van het periosteum. (B, C) Dit paneel toont de markering van de plaats voor de katheter op 2 mm posterieure van Bregma en 2,4 mm zijdelings naar rechts vanaf de sagittale hechting; evenals de plaatsen voor de gaten die bestemd zijn voor de drie ankerschroeven met een gepaste afstand van de katheter en Lambda. (D) Na het boren van het kathetergat (een diameter van 0,5 mm, met een ronde boortip) en de gaten voor de ankerschroeven (1,3 mm diameter met een gedraaide boortip) worden de ankerschroeven vastgedraaid. (E, F) Vervolgens wordt de katheter ingebracht en wordt de hele opstelling gestabiliseerd met polymeriserend tandcement. (G) De wond is gehecht met twee of drie knopen voor en achter op de katheter. B = Bregma; L = Lambda; C = Katheter; S1, S2 en S3 = plaatsen voor de gaten voor de drie ankerschroeven. De schaalbalken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3: Bereiding van rMOG/IFA emulsie. (A) Het mengsel van rMOG, PBS en IFA wordt geëmulgeerd door het entmateriaal van de entspuit naar de andere te drukken door de zuigers heen en weer te duwen, (B) totdat het wit en stroperig is. (C) Vervolgens wordt het entmateriaal verdeeld over 1 ml spuiten voor de injectie. 5 μg rMOG wordt gebruikt in 200 μL PBS/IFA-mengsel om één rat subklinisch te immuniseren; vanwege de verliezen aan de uiteinden en wanden van de spuiten tijdens de bereiding moet echter een groter volume worden voorbereid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Voorbereiding van de connector canule. (A – D) Deze panelen laten zien hoe een connector en een interne worden geassembleerd met een 2 mm formaat sjabloon gids canule. (E) De binnenkant wordt met behulp van een scalpel (F) op dezelfde grootte gesneden als de geleide canule en de sjabloongeleider wordt vervolgens losgeschroefd. (G) Het andere uiteinde van de connector canule wordt bevestigd aan een spuit van 1 ml, die het injectiemengsel bevat, met een naald van 20 G. De schaalbalken = 3 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5: Intracerebrale injectie. (A) Een programmeerbare spuitpomp wordt aangepast voor een injectiesnelheid van 2 μL/min en de 1 ml spuit gevuld met cytokinemix (of steriel PBS voor de bedieningselementen) wordt op de pomp gemonteerd. (B) Het dier wordt eerst verdoofd in de kamer met 5% isofluraan met een zuurstofstroom van 2 L/min en vervolgens (C) de anesthesie wordt door het masker ondersteund met 2,5% isofluraan met een zuurstofstroom van 1,5 L/min. (D) De katheterdop met de inlaat (de dummy canule) wordt losgeschroefd en de injectiekanule wordt via de geïmplanteerde katheter ingebracht. Omdat het volume van de injectie erg klein is, moet de onderzoeker voorzichtig zijn om luchtbellen aan de punt van de canule te vermijden. Om die reden is het belangrijk om het inbrengen te starten terwijl de pomp in bedrijf is en alleen wanneer er een groeiende vloeistofbel aan de punt is. Het extra volume gaat sowieso niet in de hersenen, omdat het voor het inbrengen op de katheter afbreekt. (E) Vervolgens wordt de connector canule vastgedraaid en wordt de pomp 10 minuten laten werken. Na 10 minuten injectie wordt de pomp gestopt en blijft de canule 15 – 20 minuten binnen om de diffusie van het geïnjecteerde volume naar de interstitiële vloeistof mogelijk te maken. De schaalbalken = 5 cm, tenzij anders aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6: PLP immunoreactiviteit in coronale hersensecties. (A) Dit paneel toont een controlebrein (MOG-geprimed) met een PBS-injectie (dag 15), wat niet resulteert in een corticale demyelinisatie. (B) Al op dag 1 post-cytokine injectie is demyelinatie zichtbaar in het kathetergebied. (C) Een breder verlies van PLP-immunoreactiviteit wordt waargenomen in de ipsitalale cortex op dag 3, (D) en aan de contralaterale kant. Wijdverspreid verlies van PLP-immunoreactiviteit wordt waargenomen bij beide hemisferen op dag 15, omdat (E) dit paneel de ipsilaterale cortex toont en (F) dit paneel de contralaterale cortex toont. (G) Een overzicht van beide hemisferen wordt gegeven in het tonen van het wijdverbreide verlies van PLP op dag 15. Op dag 30, als (H) dit paneel toont de ipsilaterale cortex en (I) dit paneel toont voor contralaterale cortex, is er nog steeds opmerkelijke demyelinatie, maar ook sommige remyelinated gebieden kunnen worden waargenomen. (J) Dit paneel toont de kwantificering van de demyelinatie (PLP-verlies in mm2/halfrond). 1,5 – 2 μm coronale hersensecties werden gebruikt voor de PLP-detectie met MS-anti-PLP met een verdunningsfactor van 1:500. De secties werden tegengehouden met hematoxyline voor celkernen. Voor gedetailleerde informatie over de immunohistochie, zie Ucal et al. 43. Paneel G en J zijn gewijzigd van Ucal c.s. 43. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 7: Hersenatrofie na tweede cytokine-injectie. (A) Dit paneel toont een controlebrein (MOG-geprimed) met een PBS-injectie (dag 15). (B) Op dag 15 na de eerste cytokine-injectie leidt een tweede injectie binnen 15 dagen tot hersenatrofie. 1,5 – 2 μm coronale hersensecties werden gebruikt voor de PLP-detectie met MS-anti-PLP met een verdunningsfactor van 1:500. De secties werden tegengehouden met hematoxyline voor celkernen. Voor gedetailleerde informatie over immunohistochie, zie Blakemore37. De schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Gemodificeerde kooien om katheterverwijdering door het dier te voorkomen. In de standaardkooien bevindt de ruimte van de voedselhouder op het rooster zich dichter bij de kooibodem, waardoor een riskante smalle ruimte ontstaat die de kans vergroot dat de katheter in de knoop raakt met het rooster en daardoor wordt verwijderd. Om dit te voorkomen, moet de kooi worden aangepast. Deze smalle ruimte werd geblokkeerd met een transparant vlak, waardoor het dier kon worden nageleefd. Het voedsel moet in deze gemodificeerde kooien in de kooi worden gegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Onze methode maakt gebruik van DA ratten. De aanpassing aan muizen vereist waarschijnlijk het gebruik van een kleinere katheter en schroeven. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat het ziekteverloop, de ontstekingsreactie en de mate van demyelinatie kunnen verschillen van wat hier wordt gepresenteerd als een andere soort / stam wordt gebruikt. Dergelijke verschillen zijn waargenomen met klassieke EAE-modellen met behulp van verschillende muizenstammen. MOG92-106 van rattenoorsprong resulteerde bijvoorbeeld in primaire progressieve of secundaire progressieve EAE bij A.SW-muizen, terwijl het relapsing-remitting EAE veroorzaakte bij SJL/J-muizen46. Dieren van dezelfde stam moeten daarom worden gebruikt. Genderverschillen in EAE-manifestatie zijn ook gemeld in verschillende eerdere studies24. Het optreden van dergelijke gendereffecten zou wel eens kunnen worden verwacht voor het hier beschreven protocol, maar moet nog worden gevalideerd in verdere experimenten.

De intraperitoneale (IP) toediening van een anestheticamengsel bestaande uit 0,02 mg/ml fentanyl, 0,4 mg/ml midazolam en 0,2 mg/ml medetomidine wordt gebruikt voor de chirurgische ingreep. Volwassen mannelijke DA-ratten met een gewicht van 270 – 300 g hebben ongeveer 0,4 – 0,6 ml van dit mengsel(d.w.z.~ 1,5 ml / kg) nodig om een anesthesie van 60 – 90 minuten op te wekken. Na de operatie wordt de anesthesie geanttagoneerd door een subcutane injectie van een tegengif bestaande uit 0,07 mg/ml flumazenil en 0,42 mg/ml atipamezol in fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl). Een dosis van 1 – 1,5 ml/kg antagoniseert de anesthesie binnen 5 minuten. Als alternatief kunnen de dieren spontaan wakker worden na een fysiologische uitwas uit de verdoving, maar in dat geval moeten de dieren onder observatie worden gehouden totdat ze volledig bij bewustzijn zijn.

Andere anesthesieopties die vaak worden gebruikt voor dieroperaties, zoals een IP-injectie van ketamine en xylazine47 of natriumpentobarbital48, of een inademing van vluchtige anesthetica zoals isofluoraan49 en halothaan50, kunnen ook worden overwogen voor de hier gepresenteerde operatie. Het is echter van cruciaal belang om een verdovingsmiddel te kiezen dat de beoogde downstreaminterventie(s) niet verstoort.

Tijdens de immunisatie en intracerebrale cytokine injectie wordt 5% isofluraan gebruikt voor de anesthesie. Het hier beschreven model is vastgesteld met behulp van ratten en de vermelde experimentele details zijn dus specifiek van toepassing op de rat. De coördinaten van de katheterimplantatie werden geselecteerd om de gelijktijdige analyse van mogelijke veranderingen in witte stof mogelijk te maken (de kathetertip in het corpus callosum). Hoewel de inbrengende plaats van de katheter kan worden gevarieerd met betrekking tot de anteroposterior en laterale positie, vereist de selectie van de centrale sulcus het vermijden van schade aan de superieure sagittale sinus.

Een ander kenmerk van de beschreven methode is de equivalente demyelinatie van zowel ipsi- als contralaterale hemisferen, mogelijk als gevolg van het vervoer van het geïnjecteerde cytokinemengsel naar de subarachnoïde ruimte door de fysiologische stroom van de interstitiële vloeistof uit corticale regio’s51. De injectiemodus, en niet de locatie van de katheter, veroorzaakt daarom demyelinisatie in de hele hersenschors, en de keuze van de rechter- of linkerpariëtale cortex zou in dit opzicht dus niet van belang moeten zijn.

Het protocol maakt gebruik van een 26 G-katheter, die klein genoeg is om uitgebreid traumatisch letsel te voorkomen en groot genoeg om een verhoogde snelheid van verstopping van de kathetertip tijdens het lange verloop van het experiment te voorkomen. Zeker, de implantatie en de aanwezigheid van de katheter zelf veroorzaken een astrocytische en microgliale activering, ook bij de controledieren die alleen de katheterimplantatie ontvangen; dit is echter gering in vergelijking met de met cytokine geïnjecteerde dieren. Om interferentie met latere analyses te voorkomen, gebruikten we MRI-compatibele katheters gemaakt van poly-ether-ether-keton (PEEK).

Een vergelijkbare diepte van demyelinatie wordt in feite gecreëerd in zowel ipsi- als contralaterale regio’s met de gepresenteerde methode. Dit houdt in dat de diepte/lengte van de katheter mogelijk geen grote rol speelt in het patroon en de mate van demyelinatie in de cortex. Daarom kan een wijziging van de katheterlengte worden overwogen om de door de katheter geïnduceerde laesiegrootte te verminderen. Niettemin kan een aanzienlijk kortere katheterlengte een iets minder uitgesproken corticale demyelinatie veroorzaken, terwijl een sluitend antwoord alleen wordt verkregen door experimenten die specifiek op de lengte van de katheter worden getest.

Een voordeel van het model is dat de geïmplanteerde katheter het mogelijk maakt om potentiële therapieën die via de katheter aan de cortex worden toegediend, te testen om remyelinisatie op of na de piek van histologisch detecteerbare corticale demyelinisatie (dag 15 of later) mogelijk te maken, terwijl dit in een voorbehandelingsinstelling na de immunisatie zou zijn, maar vóór de cytokine-injectie. De beslissing over het tijdsbestek waarin therapeutische geneesmiddelen zouden worden toegediend, zal daarom afhangen van de specifieke onderzoeksvraag en het geneesmiddel van belang.

Na katheterimplantatie is het belangrijk om dieren alleen in de aangepaste (bij voorkeur hoge bovenkant) kooien te huisvesten om katheterverwijdering tot het einde van het onderzoek te voorkomen (figuur 8). Dieren kunnen ook de katheterdop met de inlaat losschroeven, hoewel dit zelden gebeurt. De dieren moeten dagelijks worden geobserveerd en verwijderde doppen moeten worden vervangen door verse, om verstopping van de kathetertip bij afwezigheid van een inlaat te voorkomen en om een nauwkeurige levering in het parenchym na de intracerebrale injectie te garanderen. De dieren worden op zijn vroegst 2 weken na de katheterimplantatie geïmmuniseerd om de genezing en afsluiting van de bloed- hersenbarrière mogelijk te maken.

Serum anti-MOG antilichaam titers moeten worden gemeten na de immunisatie. Een dosis-respons experiment toonde aan dat 5 μg MOG1-125 (in IFA) voldoende immunisatie binnen 4 weken bij volwassen mannelijke DA ratten. Een titer van 5.000 μg/ml en hoger zou voldoende zijn, maar zal zeker afhankelijk zijn van verschillende factoren, waaronder het MOG-preparaat en de dierstam, en zal dus individueel moeten worden bepaald. Het is belangrijk om te hoge antigeendoses te vermijden die mogelijk resulteren in een klassiek EAE-fenotype met verlamde achterpoten, zelfs vóór de cytokine-injectie.

Elk dier wordt geïmmuniseerd met 5 μg recombinant myeline oligodendrocyt glycoproteïne (rMOG1-125) geëmulgeerd in 200 μL onvolledig Freund’s Adjuvans (IFA). Omdat een deel van de emulsie tijdens de bereiding in de spuit verloren gaat, is het raadzaam om meer dan deze hoeveelheid voor elk dier te bereiden. We gebruikten recombinant MOG (1-125 van het N-eindpunt van rat MOG), dat werd uitgedrukt in Escherichia coli en vervolgens werd gezuiverd tot homogeniteit door chelaatchromatografie, opgelost in 6 M ureum, en gedialyseerd tegen PBS om een fysiologisch preparaat te verkrijgen52,53. In de handel verkrijgde MOG kan echter ook worden gebruikt.

Andere antigeenpreparaten, zoals MOG1-116, MOG35-55 of PLP139-151 worden gebruikt in verschillende EAE-modellen, en het is bekend dat verschillen in antigeen en dierlijke stam verschillende ziektefenotypen induceren in deze modellen20. Deze antigeenpreparaten werden niet getest bij DA-ratten en kunnen, indien gebruikt in plaats van rMOG1-125,een ziektefenotype of histologische resultaten veroorzaken die verschillen van wat hier wordt gepresenteerd.

Een connector canule van dezelfde lengte als de katheter wordt voorbereid voorafgaand aan de intracerebrale injectie. Dit kan door het te monteren met een sjabloonkatheter en het op dezelfde grootte (2 mm lang) te snijden (figuur 4). Het is belangrijk dat de connector canule luchtbelvrij is tijdens de cytokine injectie- omdat het injectievolume slechts 2 μL is, zal zelfs een kleine luchtbel aan de canulepunt het volume van de vloeistof die met succes in de hersenen wordt geleverd aanzienlijk verminderen. Dit wordt bereikt door de pomp draaiende te houden en de canule alleen in te brengen wanneer er een groeiende druppel injectievloeistof aan de punt aanwezig is. Na het inbrengen van de canule wordt de connector aan de katheter geschroefd, terwijl oververdichting wordt vermeden om de bovenste punt van de katheter niet te beschadigen, waardoor het moeilijk zal zijn om na de injectie opnieuw in te korten. Een injectiesnelheid van 0,2 μL/min wordt gebruikt om injectie-geïnduceerd trauma te voorkomen. Bovendien zorgt een langzame injectie, in combinatie met een wachttijd van 20 minuten na de injectie, voor de diffusie van de geïnjecteerde vloeistof in de interstitiële vloeistof en een effectieve afvoer in het CSF. De canule wordt vervolgens langzaam verwijderd om een vacuümeffect te voorkomen.

De gerapporteerde methode omvat chirurgische ingrepen en vereist daarom personeel dat in staat is om stereotactische overlevingsoperaties uit te voeren. Personeel dat in direct contact staat met de dieren moet de juiste dierproeven hebben gevolgd. De rest van het protocol kan worden uitgevoerd door bevoegde lableden.

De methode is bedoeld om ontstekingsgeriggereerde demyelinatie van de hersenschors te produceren en reproduceert niet alle kenmerken van menselijke MS(bijv.het optreden van focale inflammatoire wittestoflaesies, wat een kenmerk is van menselijke MS).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen alle medewerkers van het Institute of Biomedical Research van de Medical University Graz bedanken voor hun hulp en medewerking, evenals Christopher John Wrighton voor het proeflezen van het manuscript.

Materials

Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) 
Fentanyl Hameln pharma plus, Germany  as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml
Midazolam ERWO Pharma, Austria 50039017 5 mg/ml
Medetomidin  Orion Pharma, Finland as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml
Flumazenil  Roche, Switzerland 0.1 mg/ml
Atipamezol  Orion Pharma, Finland as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml
10% povidone-iodine complex  Mundipharma, Austria
Dental cement  Heraeus Kulzer, Germany 6603 7633
Physiological saline solution  Fresenius Kabi, Austria 0.9% NaCl
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Germany P3813
Isofluorane  AbbVie, Austria
Lubricating eye drops  Thea Pharma, Austria
70% EtOH Merck, Germany 1070172511 Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v
2.5% enrofloxacin Bayer, Germany Prophylactic antibiotics 
carprofen Pfizer, USA Painkillers, 50 mg/ml 
Tween-20  Sigma-Aldrich, Germany P9416
Pentobarbital  Richter Pharma, Austria pentobarbital sodium, 400 mg/ml
Interferon gamma  PeproTech, USA  400-20
Tumor necrosis factor alfa R&D Systems, USA 510-RT-050/CF
rMOG1-125 own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Anti-MOG antibody  Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan AS-555157 Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka  
Incomplete Freund’s adjuvant  Sigma-Aldrich, Germany  F5506
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody  Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan AS-555157 Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich, Germany A9576
Peroxidase substrate solution Vector Laboratories, USA SK-45000
Stereotactic frame  David Kopf Instruments, USA
Catheters, MRI suitable  PlasticsOne, USA 8IC315GPKXXC
Dummy cannulas  PlasticsOne, USA 8IC315DCNSPC
Plastic screws, MRI suitable  PlasticsOne, USA 8L080X093N01
Connector cannula  PlasticsOne, USA 8IC313CXSPCC
Screw driver with 2mm tip-size
Drill with flexible shaft extension  Proxxon, Germany NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,  
Drill bit, round, 0.5 mm  Hager & Meisinger, Germany  REF310 104 001 001 009
Drill bit, twisted, 1.3 mm  Hager & Meisinger, Germany  REF350 104 417 364 013
Scalpel  Braun, Germany BB510
Scalpel handle  Fine Science Tools, Germany 91003-12
Cotton tip applicator  Henry Schein Medical, Austria 900-3155
Surgical scissors Fine Science Tools, Germany 14101-14, 14088-10 
Surgical forceps Fine Science Tools, Germany 11002-12, 11251-35
Bulldog clamps  Fine Science Tools, Germany 18050-35
Homoeothermic blanket  TSE systems, Germany
Infrared Lamp Beurer, Germany 616.51
Dental curing light  Guilin Woodpecker Medical, China
Absorbable suture  Johnson & Johnson, Belgium V792E
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA AL-1000
Exam gloves
Surgical gown
Electric Shaver Aesculap, Germany GT420
Volatile anesthetic vaporizer  Rothacher Medical, Switzerland CV 30-301-D
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer Air Liquide, Austria 19,113
Volatile anesthesia chamber  Rothacher Medical, Switzerland PS-0347
Anesthesia mask for rats  Rothacher Medical, Switzerland PS-0307-A
1 ml syringe  Codan, Denmark REF 62.1612
26 Gauge needle for injection  Braun, Germany 4657683
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization  Braun, Germany 4657519
Luer lock tip glass syringes  Poulten & Graf, Germany 7.140-37
3 way stopcock  Becton Dickinson, Sweden 394600
96-well plate  Thermo Fisher Scientific, USA 442404
Plate reader  Cole-Parmer, USA EW-1396-00
37°C incubator Kendro, Germany 50042301
Micropipettes  Gilson, USA F167350
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berkovich, R. Treatment of acute relapses in multiple sclerosis. Neurotherapeutics. 10 (1), 97-105 (2013).
  2. Kalincik, T. Multiple Sclerosis Relapses: Epidemiology, Outcomes and Management. A Systematic Review. Neuroepidemiology. 44 (4), 199-214 (2015).
  3. Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. The Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
  4. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus Placebo in Primary Progressive Multiple Sclerosis. The New England Journal of Medicine. 376 (3), 209-220 (2017).
  5. Dyment, D. A., Ebers, G. C., Sadovnick, A. D. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 3 (2), 104-110 (2004).
  6. Ascherio, A. Environmental factors in multiple sclerosis. Expert Review of Neurotherapeutics. 13, 3-9 (2013).
  7. Allen, I. V., McQuaid, S., Mirakhur, M., Nevin, G. Pathological abnormalities in the normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Neurological Sciences. 22 (2), 141-144 (2001).
  8. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2705-2712 (2005).
  9. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the Neurological Sciences. 233 (1-2), 55-59 (2005).
  10. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  11. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 50 (3), 389-400 (2001).
  12. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical demyelination in multiple sclerosis: a substrate for cognitive deficits. Journal of the Neurological Sciences. 245 (1-2), 123-126 (2006).
  13. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
  14. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathology. 27 (2), 123-137 (2017).
  15. Lebar, R., Lubetzki, C., Vincent, C., Lombrail, P., Boutry, J. M. The M2 autoantigen of central nervous system myelin, a glycoprotein present in oligodendrocyte membrane. Clinical and Experimental Immunology. 66 (2), 423-434 (1986).
  16. Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., Vass, K. Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. The American Journal of Pathology. 130 (3), 443-454 (1988).
  17. Panitch, H., Ciccone, C. Induction of recurrent experimental allergic encephalomyelitis with myelin basic protein. Annals of Neurology. 9 (5), 433-438 (1981).
  18. Tuohy, V. K., Sobel, R. A., Lees, M. B. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. The Journal of Immunology. 140 (6), 1868-1873 (1988).
  19. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  20. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1952-1960 (2006).
  21. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  22. McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
  23. Bebo, B. F., Vandenbark, A. A., Offner, H. Male SJL mice do not relapse after induction of EAE with PLP 139-151. Journal of Neuroscience Research. 45 (6), 680-689 (1996).
  24. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. The Journal of Immunology. 171 (1), 462-468 (2003).
  25. Scheld, M., et al. Neurodegeneration Triggers Peripheral Immune Cell Recruitment into the Forebrain. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1410-1415 (2016).
  26. Chanaday, N. L., Roth, G. A. Microglia and astrocyte activation in the frontal cortex of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 314, 160-169 (2016).
  27. Pomeroy, I. M., Matthews, P. M., Frank, J. A., Jordan, E. K., Esiri, M. M. Demyelinated neocortical lesions in marmoset autoimmune encephalomyelitis mimic those in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2713-2721 (2005).
  28. Merkler, D., et al. Differential macrophage/microglia activation in neocortical EAE lesions in the marmoset monkey. Brain Pathology. 16 (2), 117-123 (2006).
  29. Storch, M. K., et al. Cortical demyelination can be modeled in specific rat models of autoimmune encephalomyelitis and is major histocompatibility complex (MHC) haplotype-related. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 65 (12), 1137-1142 (2006).
  30. Ludwin, S. K. Central nervous system demyelination and remyelination in the mouse: an ultrastructural study of cuprizone toxicity. Laboratory Investigation. 39 (6), 597-612 (1978).
  31. Skripuletz, T., et al. Cortical demyelination is prominent in the murine cuprizone model and is strain-dependent. The American Journal of Pathology. 172 (4), 1053-1061 (2008).
  32. Norkute, A., et al. Cuprizone treatment induces demyelination and astrocytosis in the mouse hippocampus. Journal of Neuroscience Research. 87 (6), 1343-1355 (2009).
  33. Acs, P., et al. 17beta-estradiol and progesterone prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice. Glia. 57 (8), 807-814 (2009).
  34. Pott, F., et al. Cuprizone effect on myelination, astrogliosis and microglia attraction in the mouse basal ganglia. Brain Research. 1305, 137-149 (2009).
  35. Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. Journal of Neurocytology. 24 (10), 775-781 (1995).
  36. Blakemore, W. F. Ethidium bromide induced demyelination in the spinal cord of the cat. Neuropathology and Applied Neurobiology. 8 (5), 365-375 (1982).
  37. Mason, J. L., et al. Oligodendrocytes and progenitors become progressively depleted within chronically demyelinated lesions. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1673-1682 (2004).
  38. Franco, P. G., Silvestroff, L., Soto, E. F., Pasquini, J. M. Thyroid hormones promote differentiation of oligodendrocyte progenitor cells and improve remyelination after cuprizone-induced demyelination. Experimental Neurology. 212 (2), 458-467 (2008).
  39. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  40. Kerschensteiner, M., et al. Targeting experimental autoimmune encephalomyelitis lesions to a predetermined axonal tract system allows for refined behavioral testing in an animal model of multiple sclerosis. The American Journal of Pathology. 164 (4), 1455-1469 (2004).
  41. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
  42. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
  43. Gardner, C., et al. Cortical grey matter demyelination can be induced by elevated pro-inflammatory cytokines in the subarachnoid space of MOG-immunized rats. Brain. 136, 3596-3608 (2013).
  44. Minagar, A., et al. The thalamus and multiple sclerosis: modern views on pathologic, imaging, and clinical aspects. Neurology. 80 (2), 210-219 (2013).
  45. Tsunoda, I., Kuang, L. Q., Theil, D. J., Fujinami, R. S. Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathology. 10 (3), 402-418 (2000).
  46. Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behavioural Brain Research. 177 (2), 347-357 (2007).
  47. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
  48. Leonard, J. R., Grady, M. S., Lee, M. E., Paz, J. C., Westrum, L. E. Fluid percussion injury causes disruption of the septohippocampal pathway in the rat. Experimental Neurology. 143 (2), 177-187 (1997).
  49. Hare, G. M., et al. Severe hemodilutional anemia increases cerebral tissue injury following acute neurotrauma. Journal of Applied Physiology. 103 (3), 1021-1029 (2007).
  50. Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochemistry International. 45 (4), 545-552 (2004).
  51. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. The Journal of Immunology. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  52. Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Hochmeister, S., Gustafsson, S. A., Jagodic, M. Efficacy of vitamin D in treating multiple sclerosis-like neuroinflammation depends on developmental stage. Experimental Neurology. , 39-48 (2013).

Tags

RatCerebral CortexDemyelinationPro-inflammatory CytokinesMultiple SclerosisCatheter ImplantationStereotactic SurgeryCortical InflammationGray Matter DemyelinationAnchor Screws

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Üçal, M., Haindl, M. T., Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Schaefer, U., Fazekas, F., Hochmeister, S. Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines. J. Vis. Exp. (175), e57879, doi:10.3791/57879 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image