炎症性サイトカインの脳内注射による広範囲にわたる大脳皮質脱髄のラットモデル

ここに記載されているすべての方法は、地方自治体によって承認されています (ブンデスミニウム・フュル・ウィセンシャフト・ウント・フォルシュン (オーストリア科学研究省);ライセンス番号: 66.010/0132-WF/V/3b/2014)。成人の雄のDAラット(10〜12週齢)は、食物および水への自由なアクセスを伴う12/12時間の明暗サイクルに収容された。 1. 材料の準備注:手術は無菌状態で行われます。開始する前に、ドリルビットを含むすべての手術器具が適切な消毒剤で洗浄されていることを確認してください。 フェンタニル0.02mg/mL、ミダゾラム0.4mg/mL、メデトミジン0.2mg/mL(混合物中の最終濃度)の麻酔混合物を調製します。注: 代替麻酔薬については、それぞれの 説明 セクションを参照してください。 解毒剤混合物を調製する:0.07mg/mLのフルマゼニルと0.42mg/mLのアティパメゾール(混合物中の最終濃度)。 カテーテルとカテーテルキャップを入口とネジで組み立てます。カテーテルをメスで2mmの長さに切ります(図1)。注:カテーテル先端の円形の断面形状を絞り、歪めるので、これにはハサミを使用しないでください。 2. 外科手術の準備 腹腔内投与(すなわち)の麻酔混合物(体重1.5mL/kg)でラットを麻酔します。 電気剃毛を使用して、耳の間でラットの頭を剃ります。動物を配置する前に、体性の高いフレームに家庭性毛布を置き、手術中の低体温症を避ける。 耳の棒と一口プレートを使用して、立体フレームにラットの頭を固定し、頭が水平かつ安定していることを確認します。指や鉗子で頭蓋骨に圧力をかけ、安定性を確認します。注: 定位フレーム内の緩い固定と非水平位置は、意図した座標からのずれが生じることがあります。 手術中の角膜乾燥を防ぐために潤滑用点眼剤を塗布してください。任意の外科的光暴露を防ぐために不透明な材料で目を覆います。 70%エタノールと10%ポビトン-ヨウ素複合体の塗布を交互に行うことによって、剃毛領域をきれいにします。注:感染を避けるために、手術中のすべての予防措置に従ってください。手術は無菌状態で行われます。もし敗血症が壊れているなら、汚染された物質を取り替えなければいい。 3. カテーテルの注入 頭部皮膚の中央に約2cmの長さの切開を行います。ブルドッグクランプを使用して、皮膚を側面に固定します。これらの手順の概要については、図 2を参照してください。 綿の先端のアプリケーターを使用して血液を取り除く。 頭蓋骨の骨膜を取り除く。綿先端アプリケーターで組織をきれいにし、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨を約1分間乾燥させます。 解剖学的ランドマーク、ラムダ、ブレグマ、内側縫合糸を特定します。ドリルを立体フレームに取り付けた後、ブレグマにドリルチップを開始点として配置します。ブレグマから2mm後部を移動し、内側縫合糸に横に〜2.4mm移動します。 この位置でカテーテルの直径0.5mmの穴を開けます。骨のほこりをやさしくふくらませます。メモ: 硬膜は掘削中はそのまま残ることが重要です。これを確実にするために、1)定位フレームに設置できるドリルを使用し、2)掘削中に頻繁に穴を検査し、3)小さなステップでドリルダウンする- 頭蓋骨にあまりにも多くの圧力が加えられると、ドリル先端が続き、頭蓋骨が完全に浸透したときに脳を損傷する。 第1の穴から数ミリメートル離れたアンカーねじに対して、さらに穴3(直径1.3mm程度)をドリルします。骨のほこりをそっと吹き飛ばします。注:カテーテルの上(直径が2ミリメートル)とアンカースクリュートップ(約1mm)のための十分なスペースを提供するアンカースクリューの位置を選択します。 約1-2 mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または注射器を使用した生理食塩水で骨粉を除去します。頭蓋骨をきれいにします。アンカーねじを2~3回完全に締めます。注:アンカーネジは、歯科用セメントを保持することによってセットアップを安定させるために必要であり、それによってカテーテルを所定の位置に保持します。アンカースクリューを締め付ける間は、鉗子で上にそっと持ち上げて簡単に取り外しができないようにしてください。カテーテル自体の移植は組織外傷を引き起こすので、アンカーネジの掘削中または引き締め中に追加の硬膜損傷は、複数の外傷を引き起こし、グループ内の比較可能性を妨げる可能性があります。最初にアンカーネジを締め、最後にカテーテルを挿入します。 頭蓋骨の表面に垂直な最初の穴から2mmの長さのカテーテルを挿入します。カテーテルを保持したまま、少し歯科用セメントを塗布し、カテーテルを安定させるために歯科用硬化光への短時間(〜5s)曝露で重合させ、次のステップで両手の使用を可能にする。注意:歯科硬化光を使用している間は、この光の高強度が原因で、被用領域から反射されたチップや光を直接見ないようにしてください。適切な保護ゴーグルを使用してください。 カテーテルの周りにより多くの歯科セメントを適用し、ネジを固定し、歯科用硬化光(〜15〜30s)で歯科セメントを固めます。鉗子の先端でセメントの硬化を確認します。 4. 創傷の閉閉と麻酔の拮抗 カテーテルに対するリソーブル縫合糸、前部および後部で頭部の皮膚を閉じる。注:移植の終わりに頭蓋骨の上にでこぼこセットアップがあるので、それに応じて創傷閉鎖を行います。皮膚を持ち上げすぎると、動物に不快感を与えます。 26G針の1 mL注射器を使用して、皮下(体重1.5mL/kg)に解毒剤混合物を注入します。 予防的抗生物質治療のために皮下注射(7.5mg/kg体重)によってエンロフロキサシン(2.5%)を投与する。皮下注射による痛みの軽減のためにカルプロフェン(1mg/mL;5 mg/kg体重)とブプレノルフィン(1.2mg/kg)を投与する。 5. 術後のケアと投薬 動物を改変ケージに戻し、低体温を避けるために赤外線を適用して、1〜3時間観察下に保管します。術後の回復まで、5~10分ごとに動物を常に観察し、再配置します。回復するまで目に一定の光暴露を避けるために特別な注意を払ってください。 手術の翌日に皮下注射によるエンロフロキサシン(7.5mg/kg体重)とカルプロフェン(1mg/mL;5mg/kg体重)投与を繰り返す。ブプレノルフィンは、前の治療が72時間有効であるため、リフレッシュする必要はありません。 6. 免疫化混合物の調製 (カテーテルの移植後早い14日) 注: 準備手順中に、注射器を氷の上に置きます。 2つの10 mLルアーロックチップガラスの注射器を3ウェイストップコックの短い腕に接続し、3番目の出口を長いアームで閉じます。 接続が安全で漏れがないことを確認する:ピストン2を保持したまま、約4mLの無菌PBSをオープンシリンジに加えます。ピストン1を挿入し、両方のピストンを前後に押し出し、漏出を確認します。漏れが発生しない場合は、PBSを廃棄し、ピストン1を再度取り外します。 ピペット1 mLのIFAと50 μgのrMOG1-125 を合わせて、適切なチューブ内の滅菌PBS(pH 7.4)を用いて、混合物を2 mLの最終体積に調整します。注:準備中にシリンジの先端や壁にエマルジョンが失われるため、管理のために意図したよりも大きなボリュームを準備してください。一度に1匹以上の動物を準備する方が同様に実用的です。 希釈したIFAとrMOG1-125混合物をオープンシリンジに入れます。反対側のピストンに緩い圧力を保ちながら、ピストンを穏やかに挿入します(図3A)。 ピストンを前後に押し、一方のシリンジから他方のシリンジに駆動し、白く粘性になるまで、接種物を乳化する(図3B)。 3方向ストップコックの開いた短い腕に1 mL Luerロックシリンジを固定し、それを接種器で満たす(図3C)。すべての接種を1 mLの注射器に分配する。注射まで氷の上に保管してください。調製日に混合物を投与する。 7. 予防接種 ラットをチャンバー内のイオブルオラン(〜2分、酸素2 L/分と混合)で麻酔し、マスク(酸素1.5 L/minと混合)を介して麻酔を維持する。 21G針を用いて尾部ベースに200μLの接種液を皮下に注入します。注: 溶液が粘性であるため、注射をゆっくりと行ってください。 8. 抗体タイターの測定 抗MOG抗体の抗体を決定するために、免疫後4週間で約200μLの血液を引き出す。 96ウェルプレートのウェルにMOG(PBSでは5μg/mL)をコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。 PBSで1%ウシ血清アルブミン(BSA)でプレートを室温で1時間ブロックします。 プレートをラット血清(1:50)でインキュベートし、37°Cで2時間標準にします。 プレート3xを200 μLのPBS/ポリソルベート20で洗浄します。 プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗ラットIgG二次抗体(1:10,000)でインキュベートします。プレート3xを200 μLのPBS/ポリソルベート20で洗浄します。 ペルオキシダーゼ基材溶液1ウェルあたり100 μLを加え、室温で暗闇の中で20〜30分間インキュベートします。 405 nm波長の光学密度を測定し、標準曲線を用いて光学密度から抗体の抗体を算出します。 9. 脳内サイトカイン注射 コネクタカニューレの長さを調整します(2mm)。(準備手順については 、図 4 を参照してください。 サイトカイン混合物(TNF-αの500 ng/μL、無菌PBS中の組換えラットIFN-γの300 U/μL)で1mLシリンジを充填します。注射器をコネクタカニューレに接続します。カニューレにサイトカインの混合物を充填します。泡を避けてください。 シリンジをプログラム可能なシリンジポンプに取り付け、0.2 μL/minを注入するようにプログラムします(図5A)。ポンプを起動し、カニューレの先端に気泡の形成を避けるために動作し続けます。注:射出速度は、使用される特定のシリンジの内径を考慮に入れる必要があります。それにより、シリンジ径はポンプの設置中に登録されなければならない。 ラットをチャンバー内のイオブルラン(〜2分、酸素2 L/分と混合)で麻酔し、マスク(酸素1.5 L/minと混合)を介して麻酔を維持する(図5B および 5C)。動物は少なくとも30分間麻酔下されますので、潤滑点眼薬を塗布してください。 入口でカテーテルキャップを取り外します。コネクタカニューレをカテーテルとネジに挿入し、締め付けます(図5Dと5E)。注意:これはカテーテルの上端を破壊するので、それを締めすぎないでください。 10分間(射出の総容積は2μL)に進みます。ポンプを停止します。カテーテル内のカニューレを20分間放置し、注入された容積が完全に拡散するようにします。 コネクタカニューレを外し、真空効果を避けるためにゆっくりと取り外します。 カテーテルキャップを入口に取り付け直し、ねじ込みます。ケージ内の麻酔から回復する動物を許可します。