Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 Landesdirektion 뉴 스타트 인섹 센, 독일 (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016)의 허가 동물 복지 행위에 의해 승인 되었습니다가지고. 1입니다. 준비 참고:이 프로토콜은 이중 유전자 변형 Tg에서 zebrafish 주 섬의 비보 전 영상 (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 제 브라. 이 유전자 변형 라인에서 인슐린 발기인 (ins) 드라이브 두 transgenes의 베타 세포 특정 식: nls-Renilla-mKO2, 단위체 Kusabira 오렌지 2 (mKO2)와 베타 세포의 핵을 표시 형광; 그리고 GCaMP6s15, 세포내 칼슘 수준에 증가에 대 한 응답에서 녹색 형광을 방출 한다. GCaMP6s의 베타 세포 특정 식 세포 유형 주변에 칼슘 변화에서 간섭 없이 베타 세포의 포도 당 응답을 공부 하 고 있습니다. 캘리포니아2 +/Mg2 +의 1 mL에 소 fibrinogen의 10mg을 용 해 하 여 신선한 fibrinogen 주식 (10mg/mL) 준비-행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 들어 있는. Fibrinogen 파우더까지 적극적으로 소용돌이 완전히 녹 인 다. 더 이상 15 분 동안 실내 온도에 솔루션을 계속.참고: 재고 솔루션 유해를 시작 하 고 점성 된다 경우 2-3 헤 취소 재고에 대 한 실 온에서 보관할 수 있습니다. 3 겹에 HBSS fibrinogen 주식을 diluting 하 여 fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)을 준비 합니다. 예, fibrinogen 재고 fibrinogen 작업 솔루션의 900 µ L를 준비 하는 HBSS의 600 µ L에서 300 µ L를 혼합. 10을 용 해 하 여 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)를 준비 단위 HBSS 또는 인산 염의 1 mL에 트 롬 빈의 버퍼링 식 염 수 (PBS).참고:이 솔루션 50 µ L 부분에 aliquoted 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 언 물 50 mL에 D-포도 당 1.8 g을 용 해 하 여 200 m m D-포도 당 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지. 물 50 mL에 KCl의 1.1 g을 용 해 하 여 300 mM KCl 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지. 장착은 독도 대 한 35 m m 직경 유리 하단 요리를 조달. 해 부 및는 섬에의 설치 사용 하 여 형광 램프와 빨간 필터 큐브 스테레오 현미경 (TRITC: 여기: 532-554 nm, 방출: 570-613; 또는 텍사스-레드: 여기: 540-580 nm, 방출: 592-667 nm). 이미징 (0.8 없음) X 20는 거꾸로 confocal 현미경 (LSM 780 또는 이와 유사한 Zeiss) 목표 공기와 35 m m 직경 유리 하단 요리 접시 홀더 장착 사용에 베타 세포에서 칼슘의 유입에 대 한. Zebrafish는 euthanizing tricaine 메탄 된 (MS222)의 200 mg/L 솔루션 준비. Zebrafish 해 부에 대 한 90 mm 페 트리 접시를 조달. 2. 제 브라 주 섬 해 부 및 장착 MS222에서 머리말 붙인된 외피를 사용 하 여 물고기 안락사 이 위해 부드럽게 낚시 그물을 사용 하 여 어항에서 물고기를 제거 하 고 동물 opercular (아가미) 운동; 표시 될 때까지 MS222 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시에 그것을 품 어 일반적으로,이 걸립니다 5 분 전송 물고기 Ca2 +/Mg2 +HBSS 솔루션을 포함 하는 배양 접시에. 스테레오 현미경 형광 램프와 빨간 필터 큐브, 췌를 동물의 복 부의 오른쪽을 덮고 피부를 해 부. 이 대 한 날카로운 집게를 사용 하 여 항문 지 느 러 미에 입에서 zebrafish의 피부를 잘라. 복 부; 노출 컷된 피부 벗 겨 이 자르는 내부 장기 노출합니다. 베타 세포의 mKO2 식의 빨간 형광을 사용 하 여 시각적인 검사는 현미경으로 독도의 위치를 확인 합니다. 필요한 경우, 그들은 찾기 어려운 섬 표지 수 간의 돌출부를 제거 합니다.참고: 주 섬은 오른쪽에 일반적으로 복 부의 앞쪽 지역 근처에 위치. 신중 하 게 간, adipocytes 등 주변 조직을 제거 하 여 주 섬 청소. 주의 손상 또는 찌를 섬; 주변 조직의 지운 후 섬 표면에 개별 셀 될 뚜렷한. 유리 하단 접시의 중앙에 30 µ L 방울 HBSS 플라스틱 이 드롭 해 부 섬 전송. 조심 스럽게 씻어 한번 HBSS와 함께 한 번 30 µ L fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)의 작은 섬. 이렇게 하지 않으면 세포 죽음에서 발생 하기 때문에 세척 단계는 섬의 건조 하지 않도록 해야 합니다. 천천히 그리고 부드럽게 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)의 10 µ L를 추가 합니다. 섬 두고 접시 15-20 분 fibrinogen-트 롬 빈 드롭 관찰에 대 한 손길이 닿지 않은 점성 및 약간 불투명 한이 시점에서 될 것입니다. 3. 제 브라 주 독도에서 GCaMP 형광 강도의 전 비보 라이브 영상 금형 위에 HBSS의 200 µ L을 추가 하 고 confocal 현미경의 플레이트 홀더에 신중 하 게 접시를 놓습니다. 20 X, 0.8 나 공기 목표를 사용 하 여 confocal 영상에 대 한. 섬을 대물 옵션을 사용 하 여 찾습니다. 빨간 형광에 대 한 필터를 사용 하 하는 섬에 초점, 베타 세포에서 핵 mKO2 형광을 볼 수 있습니다. 개별 핵은 명확 하 게 표시 되어야 합니다. z 축 따라 섬의 두께 통해 이동 하기 위하여 공초점 현미경의 초점 비행기를 수동으로 변경 하 여 명확한 영상 평면을 찾습니다. 특히 섬 중앙에에서 핵 mKO2 형광의 밝기는 유니폼, 이미징 비행기 이미징, 베타 세포의 충분 한 수 (50-100)를 포함 확인 하십시오. “스마트 설정 메뉴”에서 다음 설정을 사용 하 여 GCaMP6s 및 mKO2 형광에 대 한 순차적 인수 설정: GCaMP6s, 여기: 488 nm, 방출: 500-555 nm, false-색상: 그린 (선택 “GFP”); mKO2, 여기: 561 nm (mCherry), 방출: 570-630 nm, false-색상: 레드 (선택 “mCherry”).참고:이 설정을 사용 하 여 빨강 채널 기록할 것 이다 베타 세포 핵의 위치 녹색 채널 GCaMP 형광 강도 기록 하는 동안. “수집 모드”에서 1024 x 1024 픽셀에서 이미지 해상도 설정, 10와 1에서 평균 속도. 연속 시작 “시계열”에 대 한 옵션을 선택 하 고 프레임 당 약 2 s 수집 시간 500 사이클, “기간”을 설정 하 여 녹음 합니다.참고: 시간 시리즈의 처음 50 프레임 5 mM 포도 당 농도에서 베타 세포의 활동에 해당합니다. 이것은 초기 응답 이다. 응답 베타 셀 왁 싱 시간 녹색 형광 강도 말기 표시 됩니다. 우리는 몇 가지 (1-5%)는 베타 세포의 5 mM 포도 당에서 진동 관찰. 이미징 사이클에 잘 감시 해. 처음 50 프레임 후 녹화를 중지 하지 않고 10 m m 주변 솔루션의 포도 당 농도 증가. 이미지 수집, perturbing 없이 부드럽게 200mm는 섬 들고 젤 위에 D-포도 당 솔루션의 5 µ L 플라스틱. 10 m m 포도 당에서 150 프레임을 획득 합니다.참고: 포도 당 농도 증가의 베타 세포 수 증가 GCaMP 형광 진동 녹색 채널에 받고. 유지 하는 세포의 핵 안정 과정에서. 섬 중 광범위 하 게 떨고 핵 초점 평면에서 이동 하는 경우 (필요한 경우) 샘플 삭제. 다음 샘플의 안정성을 보장 하기 위해 fibrinogen-트 롬 빈 금형의 합 수 있도록 충분 한 기간을 기다립니다. 200 프레임에서 더 부드럽게 200 m m D-포도 당 솔루션의 10 µ L를 pipetting으로 20 mm 용액의 농도 증가. 20 mM 농도 대 한 150 프레임을 획득 합니다. 350 프레임 후 섬 KCl의 30 m m를 사용 하 여 depolarize. 이 위해 20 µ L 300 m m KCl 재고 솔루션을 추가 합니다. 이 단계에서 관찰 GCaMP6s 형광 진동 중지 하 고 고 강도;에 수정 베타 세포 포도 당에 반응 하지 않았다 또한 KCL 추가 시 녹색 형광 강도 증가 표시할 수 있습니다. 4. 개별 베타 세포에 대 한 GCaMP 형광 추적의 정량화 참고: 추적 하 고 개별 베타 세포의 포도 당 수준의 응답 계량, 전체 이미징 동안 GCaMP 형광 강도 수량화 합니다. 정량화는 셀룰러 해상도에서 수행 됩니다. 이 위해 피지20 을 사용 하 여 이미지 (4.1-4.6 단계), 그리고 스프레드시트 소프트웨어 또는 분석 (4.8-4.9 단계)를 수행 하려면 R21 에서 GCaMP 형광의 강도 값을 추출. 피지 “LSM 도구 상자”를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다. 이 위해 선택 “플러그인 | LSM 도구 상자 | LSM 도구 상자 표시 “. “LSM 도구 상자”, “오픈 LSM”를 클릭 하 고 이미지 파일을 선택 합니다.참고: “LSM 도구 상자”에서 지원 되지 않는 형식에 대 한 변환 분석을 위한 티파니를 먼저. 피지에서 관심 영역 (ROI) 도구를 사용 하 여 셀의 응답을 압축을 풉니다. “도구” 아래 “분석” 메뉴에서 “투자 수익 관리자”를 엽니다. 도구 모음에 있는 “다각형 선택 도구”를 사용 하 여 투자 수익을 수동으로 그립니다. 베타 세포 핵 되 빨강 채널에 투자 수익을 그립니다. 셀의 세포질의 일부를 포함 하려면 셀의 핵 보다 더 큰 영역을 커버 하는 투자 수익을 선택 합니다. 투자 수익 위치 프레임 사이의 일치 하는지 확인 하 고 필요한 경우 위치를 조정 합니다. “[T] 추가” 버튼을 클릭 하 여 선택한 ROIs “ROI 관리자”를 추가 합니다. 선택한 여러 셀에 데이터를 얻기 위해 투자 수익에 여러 ROIs를 추가 합니다. 다음, “분석” 메뉴에서 “설정 측정” 선택 합니다. 지정 지역 내에 총 형광 강도의 추출에 대 한 “통합 밀도”를 선택 합니다. GCaMP 형광을 포함 하는 녹색 채널을 shift 하 고 “ROI 관리자”에서 “멀티 측정”를 선택 합니다.참고:이 시간 시리즈를 통하여 셀에 대 한 강도 측정을 제공할 것입니다. 경우에 투자 수익 위치는 섬의 움직임으로 인해 조정 될 필요가 있다, 수동으로 다른 프레임의 강도 측정을 컴파일하십시오. 복사 하 고 별도 스프레드시트에 값을 붙여 넣습니다. “LSM 도구 상자”에서 이미지 프레임의 타임 스탬프를 가져옵니다. 사용 “우표 적용 | T 우표 적용 | 파일 이름 | 덤프 텍스트를 “타임 스탬프를. “다른 이름으로 저장” 옵션을 사용 하 여 타임 스탬프를 저장 하거나 스프레드시트에 복사 합니다. 모든 셀에 대 한 강도 값을 컴파일 시 분석 한 셀에 한 번 또는 자동으로 (예를 들어, Excel 수식 또는 R를 사용 하 여)을 수행 합니다. 2 단계에서 개별 셀을 분석 합니다. 첫 번째 단계에서 기준선 위에 형광 강도 계산 합니다. 이 위해, 처음으로 50 프레임 (5 mM 포도 당)에 대 한 형광 강렬의 평균으로 기준 형광 강도 (F0)을 계산 합니다. 기준선 (0F) 전체 시계열에서 뺍니다 (F-F0).참고: 몇 가지 세포는 일반적으로 더 높은 농도와 자극을 다음 기저 포도 당에서 분명 GCaMP 진동 표시할 수 있습니다. 이러한 셀만 있는 셀 형광에 한 방울을 보여준 초기 프레임의 평균 강도 취 함으로써 F0 를 추정 가능 하다. 분석의 두 번째 단계에서 형광 강도 정상화 하 여 최종 GCaMP 형광 강도 얻을.참고:이 다른 동물에서 독도 간의 차이 제거 수행 됩니다. 개별 독도 포도 당 자극에 따라 형광 방출의 다양 한 레벨을 표시합니다. 높은 강도 값으로 그것을 분할 하 여 형광 강도 정상화. 이 위해 (F최대 -F0), 피크 강도 계산 하 고 피크 강도 최종 GCaMP 형광 강도를 뺀 초기 계획 값을 나누어 (F-F0) / (F최대 -F0). 건강에 해로운 또는 손상 될 수 있습니다 다음 KCl 자극 강도에 변화를 전시 하지 않는 셀을 삭제 합니다. R에서 (단계 4.9-4.10) 분석을 수행 하기 위한 사용 R 스크립트 (plotcelltrace. R)이이 원고와 함께 제공.