Анализ функции бета клеток с использованием одной ячейки резолюции кальция визуализации в Zebrafish островков
Summary
Бета клеток функциональность имеет важное значение для гомеостаза глюкозы в крови, который вычисляется в резолюции одной ячейки с помощью генетически закодированный репортер для притока кальция.
Abstract
Бета клеток поджелудочной железы ответ на повышение концентрации глюкозы в крови путем секреции гормона инсулина. Дисфункция бета клеток приводит к гипергликемии и тяжелых, угрожающих жизни последствий. Понимание как бета клетки действуют в физиологических условиях и какие генетические и экологические факторы могут привести к их дисфункции может привести к более вариантов лечения для больных сахарным диабетом. Возможность измерять уровень кальция в бета клетки служит важным показателем функции бета клеток, как притока ионов кальция триггеры инсулина выпуска. Здесь мы описываем протокол для мониторинга кальция, глюкозы стимулирует приток в zebrafish бета клеток с помощью GCaMP6s, генетически закодированный датчик кальция. Метод позволяет мониторинга динамики внутриклеточного кальция с резолюцией одноклеточных в ex vivo монтируется островков. Глюкоза оперативность бета-клеток в иле же может быть захвачен одновременно под концентрации различных глюкозы, которая предполагает наличие функциональной неоднородность данио рерио бета клеток. Кроме того метод обеспечивает высокую временнóго и пространственного разрешения, который раскрывает колебательный характер притока кальция при стимуляции глюкозы. Наш подход открывает двери для использования данио рерио как модель для изучения вклада генетических и экологических факторов в функции бета клеток и дисфункции.
Introduction
Наши глюкозы в крови поддерживается в узком диапазоне, в значительной степени благодаря функции эндокринной поджелудочной железы. Эндокринных роль поджелудочной железы осуществляется островки Лангерганса, которые содержат гормон секретирующих клеток. Секреции инсулина бета клетки отвечают за снижение уровня глюкозы в крови после еды, содержащих углеводы. Неадекватными инсулин секрета из бета клеток может привести к диабета1, который характеризуется постоянной высокой-глюкозы в крови. Тип 1 и тип 2 диабета, который в настоящее время затрагивает более чем 400 миллионов человек во всем мире, приводит к2заболеваемости и смертности. Исследуя молекулярных и экологические факторы, которые способствуют дисфункции бета клеток, мы сможем лучше понять как диабет типа 2 начинается и прогрессирует. Кроме того способности различать стволовых клеток человека в функциональных бета клетки в пробирке может стать источником новых бета-клеток для клеток-терапии в диабета 1 типа. В этой связи важно изучить функции бета клеток и созревания в организмах генетическая модель, чтобы получить необходимые знания для создания функциональных бета клетки в блюдо.
Бета клеток функциональность может контролироваться на уровне всего островок количественного общее количество инсулина, секретируемых в ответ глюкозы стимуляции. Этот кумулятивный подход исследования островок как единая группа клеток без дифференциации отдельных свойств ячеек. Однако анализ ответов глюкозы отдельных бета-клеток показали разнообразие функциональных свойств бета-клеток и присутствие неоднородность3. Для оценки функции отдельных бета клеток, можно контролировать внутриклеточные изменения, которые приводят к секреции инсулина4. Секреции инсулина предшествуют проникновение глюкозы в бета клетки. Глюкозы, который входит в бета клетки быстро метаболизируется в СПС. Выше внутриклеточной концентрации ATP уменьшение открытой вероятность АТФ чувствительных калия ионных каналов приводит к деполяризации бета клеток. Деполяризации открывает каналы иона кальция напряжения чувствительных и увеличивает внутриклеточного кальция. В свою очередь кальция вызывает экзоцитоз инсулина, который выходит в тираж и снижает уровень глюкозы путем поощрения утилизации глюкозы5,6,7.
Несколько стратегий были применены для изучения функции бета клеток, включая мониторинг мембранный потенциал8, прямая визуализация инсулина и везикулы экзоцитоз9и количественная оценка внутриклеточных Ca2 + приток как прокси для глюкозы оперативность10. Среди них изображений внутриклеточных Ca2 + обеспечивает преимущество расширения масштабов анализа в несколько отдельных ячеек в пределах же островок11,12, что позволяет для прямого сравнения глюкозы-реакции между Индивидуальные бета клетки. Внутриклеточные Ca2 + концентрации может контролироваться с помощью флуоресцентных красителей кальция чувствительных13 или генетически закодированный кальция показателей (GECIs)14. В то время как кальций индикатор красители отсутствие камерного типа конкретности, GECIs может быть выражено в определенной ячейке тип конкретных промоутеров. Кроме того новое поколение GECIs, например GCaMP6, обеспечивает лучшее соотношение сигнал шум наряду с быстрее временная динамика15. Здесь мы описываем полезности нового поколения GECIs, в частности GCaMP6s, чтобы визуализировать кальция в бета клетки в одной ячейки резолюции. Мы применяем этот метод к первичной островок данио рерио как наша модель выбора. В ходе эмбрионального развития бета клетки в первичной островок происходят из дорсальной и вентральной поджелудочной железы почки16. Основная островок находится в стереотипных анатомическом положении в пределах данио рерио поджелудочной железы, что позволяет его легко идентифицировать и изоляции. Бета клетки в первичной островок необходимы для глюкозы регулирования, как их генетические абляции приводит к гипергликемии17,18. Кроме того эти бета клетки становятся глюкозы реагировать во время раннего развития данио рерио19. Этот протокол может применяться также для визуализации вторичных островков, которые формируют на Постэмбриональное этапах. Протокол позволяет изображения бета клетки ex vivo, на более поздних стадиях развития и под определенными глюкозы концентрации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы продемонстрировать технику для количественной оценки реагирования глюкозы бета клеток в одной резолюции. Это стало возможным путем мониторинга внутриклеточной концентрации кальция с помощью индикатора генетически закодированный кальция, GCaMP6s. Активность бета клеток является захваченных ex vivo , монтируя островок в тромбина Фибриноген плесень. Важнейшим шагом протокола является стабильность формы. Необходимо достаточное время для фибриноген раствориться в HBSS решения. Без этого плесень не полимеризоваться достаточно обеспечить стабильность во время визуализации сессии. Островок монтируется в тромбина Фибриноген плесени и погружен в СМИ культуры клеток может оставаться жизнеспособным для по крайней мере неделю (данные не показаны). Альтернативы тромбина Фибриноген плесени, таких как температура расплава агарозы, могут быть использованы для монтирования островок22. Другой критический параметр — рассечение островок. Во время этого шага тканей, окружающих островок необходимо удалить без ранив или тыкать островок. Умелыми дисекция приходит с практикой.
Ограничение визуализации протокола является ограничение в одной плоскости конфокальный островок. Это делается для захвата динамики приток кальция в пределах отдельных бета клеток. Z-стека по всей толщине островок приводит к низкой скорости и потери колебательного сигнала от отдельных клеток. Это ограничение может быть улучшено с помощью быстрее средства конфокальный изображений например микроскопии спиннинг диск, чтобы включить захват кальция динамика в 3 измерениях. Еще одна граница будет в vivo кальция изображений12. Прозрачный характер zebrafish эмбриона или использование пигмент менее штаммов данио рерио взрослых23 может открыть возможность для в vivo изображений в будущем.
Визуализация активности бета клеток с высоким пространственным и временным разрешением позволяет исследовать функциональные гетерогенность среди отдельных бета клеток. Этот подход может помочь пролить свет на наличие бета клеток подгрупп населения. Недавно несколько исследования показали наличие подгрупп населения номинально однородных бета клетки24,25,26. Ex vivo изображений могут быть объединены с генетическими журналистами, чтобы характеризовать суб населения реакции на глюкозу. Кроме того объединяя изображения установки с фармакологическими стимуляции может позволить для проверки соединений, которые могли бы улучшить функциональность бета клеток.
В резюме представленные здесь методика позволяет количественная оценка и сравнение глюкозы реагирования для отдельных бета клеток. Это обеспечивает прямой окно в бета клетки функциональность, важным параметром в развитие диабета.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Нинов лаборатории для комментариев на рукописи, члены центра восстановительной терапии Дрезден (КГПОГ) рыбы и микроскопии фонда для оказания технической помощи. Н.н. поддерживается путем финансирования от DFG-КГПОГ, кластер передового опыта на ту-Дрезден, Немецкий исследовательский фонд (DFG) и немецкий центр для исследования мочеизнурения (DZD).
Materials
| Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
| Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
| Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
| Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| 35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
| tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
| FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
| R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
| RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
| plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |
References
- Kahn, S. E. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).
- Ogurtsova, K., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).
- Pipeleers, D. G. Heterogeneity in pancreatic beta-cell population. Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).
- MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).
- Hellman, B., et al. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, S11-S20 (1994).
- Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).
- Wollheim, C. B., Pozzan, T. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).
- Pace, C. S., Price, S. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).
- Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).
- Soria, B., Martin, F. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).
- Kenty, J. H. R., Melton, D. A. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).
- R Core Team. . R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
- Friedman, R. S., et al. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756 (2016).
- Johnston, N. R., et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).
