Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe
Summary
Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.
Abstract
Adipositas wird begleitet von einer umfangreichen Umbau des Fettgewebes in erster Linie über Adipocyte Hypertrophie. Extreme Adipocyte Wachstum führt ein schlechtes ansprechen auf Insulin, lokale Hypoxie und Entzündungen. Durch die Stimulierung der Differenzierung der funktionalen weiße Fettzellen aus Vorläuferzellen, radikale Hypertrophie der Adipocyte Bevölkerung verhindert werden kann und infolgedessen die metabolische Gesundheit des Fettgewebes verbessert werden kann, sowie eine Reduzierung der die Entzündung. Auch kann durch die Stimulierung einer Differenzierung der Adipozyten Beige/braun, der Ganzkörper-Energieaufwand erhöht werden, was zu Gewichtsverlust. Dieser Ansatz könnte die Entwicklung von Fettleibigkeit Komorbiditäten wie Diabetes Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verhindern.
Dieses Papier beschreibt die Isolation, Erweiterung und Differenzierung der weiße und Beige Adipozyten aus einer Teilmenge von menschlichen Fettgewebe Endothelzellen, die die CD31 und CD34-Marker Co Ausdrücken. Die Methode ist relativ billig und nicht arbeitsintensiv. Es erfordert Zugang zu menschlichen Fettgewebe und das subkutane Depot eignet sich für die Probenahme. Für dieses Protokoll frisches Fettgewebe Proben aus krankhaft übergewichtigen Probanden [Body-mass-Index (BMI) > 35] werden während der bariatrischen Chirurgie Verfahren gesammelt. Mit einem sequentiellen Immunoseparation von den Stromazellen vaskulären Bruch, sind genügend Zellen von weniger als 2 – 3 g Fett hergestellt. Diese Zellen in Kultur über 10 – 14 Tage erweitert werden können, können kryokonserviert werden und behalten ihre Eigenschaften adipogenen mit bis zu 5 – 6 Durchgang passagierung. Die Zellen werden für 14 Tage mit einer adipogenen cocktail mit einer Kombination von Humaninsulin und PPARγ-Agonisten-Rosiglitazon behandelt.
Diese Methode kann verwendet werden, für den Erhalt der Nachweis der Konzept-Experimente an molekularen Mechanismen, die adipogenen Antworten in Endothelzellen Fettzellen zu fahren, oder für das screening von neuer Medikamenten, die die adipogenen verbessern können Antwort geleitet, entweder in Richtung weiß oder Beige/braun Adipocyte Unterscheidung. Mit kleinen subkutanen Biopsien, kann diese Methode zur Bildschirm aus non-Responder Probanden für klinische Studien zielte darauf ab, Beige/braun und weiße Fettzellen für die Behandlung von Adipositas und Komorbiditäten zu stimulieren.
Introduction
Aktuelle Belege dafür, dass sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen eine Teilmenge von Zellen, die ihren Wohnsitz in das Fettgewebe Gefäßsystem in entweder weiß oder Beige/braunen Fettzellen1,2,3unterschieden werden kann. Der Phänotyp dieser Zellen ist ein Thema der Kontroverse, mit Nachweise für Endothelzellen, glatte Muskulatur/Pericyte oder ein Spektrum von intermediate Phänotypen4,5,6,7. Der Umfang der Ausarbeitung dieser Methode war, das adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepots von übergewichtigen Menschen isoliert zu testen. Andere Studien in der Literatur konzentrieren sich auf das Potenzial der gesamten Stromazellen vaskulären Fraktion oder der bekannten Adipocyte Stammväter2,8,9adipogenen. Da derzeit vorhandene Technologien speziell Fettgewebe Endothelzellen für Drug Delivery10ausrichten können, ist Verständnis das Potenzial solcher Zellen adipogenen unterziehen Induktion auf weißem oder beigem Adipozyten wichtig für zukünftige gezielte Therapien.
Verschiedene Gruppen berichteten die Kombination von CD31 und CD34-Marker als Surrogate, endotheliale Zellen aus menschlichen Fettgewebe11,12,13zu isolieren. In der Regel erfolgt die Isolierung mit zwei aufeinander folgenden Schritten und eine positive Selektion mit magnetischen Beads. In diesem Bericht wurde Immunoseparation mit CD34 + magnetische Beads mit Plastikperlen CD31 kombiniert eingesetzt. Wir fanden diese Technik besser als die sequentielle magnetische Immunoseparation in Bezug auf die Erhaltung der typischen Kopfsteinpflaster endotheliale Morphologie. Darüber hinaus konnten wir erzeugen genügend Zellen für die Expansion und adipogenen Induktion ab weniger als 1 – 2 g Fett benötigt. Eine kleine Probe-Biopsie des subkutanen Fettgewebes ist genug, um die benötigte Menge an Zellen für downstream-Anwendungen zu produzieren. Dieser Aspekt ist potentiell wichtig, insbesondere dann, wenn diese Methode für das Screening für eine Reaktion auf adipogenen Induktion an Probanden genutzt wird.
Im Gegensatz zu anderen Systemen, die in der Literatur beschrieben, nutzt diese Methode nur zwei Zutaten zur adipogenen Einarbeitung von CD34 + CD31 + Zellen: einem PPARγ-Agonisten — Rosiglitazon – und Humaninsulin. Wichtig ist, fällt die Menge an Insulin verwendet in Normal/Hochton des zirkulierenden post-absorptive Insulin in Menschen14. Der Grad der Ansprechbarkeit auf Insulin von den Zellen in Vitro, gemessen durch Phosphorylierung von Akt, korreliert nicht mit ihrer Fähigkeit zur Reaktion auf die Induktion cocktail. Interessanterweise mit diesem Induktion cocktail und experimentellen Bedingungen, eine Mischung aus weiß und Beige/braunen Zellen stammen wie von der Größe und Anzahl der intrazellulären Lipid Tröpfchen und den Ausdruck von molekularen Markern bestimmt. Dieses einfache und kostengünstige Induktion Protokoll zusammen mit der quantitativen Erfassung des Phänotyps der Responder Zellen (weiße vs. Beige) ermöglicht ein Screening der Agents, die potenziell das Gleichgewicht der differenzierten Beige verändern können : weiße Fettzellen.
Diese Methode bietet auch einen translationalen Ansatz für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der angereizte des vaskulären endothelialen Vorläuferzellen im menschlichen Fettgewebe. Mit dieser speziellen Isolierung/Differenzierung Technik können Ermittler Verhören verantwortlich für angereizte in eine Teilmenge der vaskulären endothelialen Zellen aus verschiedenen Fettdepots in schlanke und übergewichtige Menschen verschiedene Wege.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Mittelpunkt dieses Papiers ist es, eine Methodik für die Isolierung, Expansion und adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelzellen von viszeralen und subkutanen Depots von menschlichen Fettgewebe zur Verfügung zu stellen.
Methoden sind berichtet worden, für die Isolierung von Endothelzellen aus verschiedenen vaskulären Betten von Nagetieren oder Menschen, bei denen in erster Linie Techniken mit CD31 Antikörper eindringmittel beschriftet oder gekoppelt mit magnetischen Beads<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren wollen Becky Marquez, der klinischen Koordinator am Sentara Bariatrisch Zentrum, für ihre Hilfe mit dem Prozess der Patient screening und Zustimmung bestätigen. Diese Forschung wurde durch R15HL114062, Anca D. Dobrian unterstützt.
Materials
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Large Equipment |
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Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
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|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
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|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
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|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
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|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
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|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
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|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
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Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
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