Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel
Summary
De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.
Abstract
Obesitas gaat vergezeld van een uitgebreide verbouwing van vetweefsel voornamelijk via adipocyte hypertrofie. Extreme adipocyte groei resulteert in een slechte reactie op insuline, lokale hypoxie en ontsteking. Door het stimuleren van de differentiatie van functionele witte adipocytes van voorlopercellen, radicale hypertrofie van de adipocyte bevolking kan worden voorkomen en, bijgevolg, de metabole gezondheid van vetweefsel verbeterd kan worden samen met een vermindering van ontsteking. Ook, door het stimuleren van een differentiatie van beige/bruin adipocytes, de totale lichaam energie-uitgaven kan worden verhoogd, wat resulteert in gewichtsverlies. Deze aanpak kan voorkomen dat de ontwikkeling van obesitas co morbiditeit zoals type 2 diabetes en hart-en vaatziekten.
Deze paper beschrijft de isolatie, uitbreiding en differentiatie van wit en beige adipocytes uit een subset van menselijk vetweefsel endotheliale cellen die mede het uitdrukken van de markeringen van CD31 en CD34. De methode is relatief goedkoop en kan niet arbeidsintensief. Het vereist toegang tot menselijke adipeus weefsel en de subcutane depot is geschikt voor monsternemingen. Voor dit protocol, verse adipeus weefsel monsters van morbide obesitas onderwerpen [index van de lichaamsmassa (BMI) > 35] worden verzameld tijdens procedures voor Bariatrische chirurgie. Met behulp van een sequentiële immunoseparation uit de stromale vasculaire afvalfractie, worden voldoende cellen geproduceerd van zo weinig zoals 2 – 3 g vet. Deze cellen kunnen worden uitgebreid in cultuur gedurende 10-14 dagen, kunnen worden cryopreserved, en behouden hun eigenschappen van de adipogenic met passaging tot de passage 5 – 6. De cellen worden gedurende 14 dagen met een cocktail met behulp van een combinatie van menselijke insuline en de PPARγ agonist-rosiglitazone adipogenic behandeld.
Deze methode kan worden gebruikt voor het verkrijgen van bewijs van concept experimenten op moleculaire mechanismen die adipogenic reacties in obesitas endotheliale cellen rijden, of voor het screenen van de nieuwe drugs die de adipogenic verbeteren kunnen reactie geleid ofwel naar wit of beige/bruin adipocyte differentiatie. Met behulp van kleine onderhuidse biopsieën, kan deze methode worden gebruikt om het scherm uit non-responder onderwerpen voor klinische tests gericht op het stimuleren van beige/bruin en wit adipocytes voor de behandeling van obesitas en co-morbiditeit.
Introduction
Recente gegevens blijkt dat zowel bij muizen en bij de mens, een subset van cellen die woonachtig zijn in het vetweefsel therapieën kan worden gedifferentieerd in ofwel wit of beige/bruin adipocytes1,2,3. Het fenotype van dergelijke cellen is een onderwerp van controverse, met bewijs ter ondersteuning van endotheliale cellen, vlotte spier/pericyte of een spectrum van intermediaire fenotypen4,,5,,6,7. De werkingssfeer van de ontwikkeling van deze methode was voor het testen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van verschillende vet depots van zwaarlijvige mensen geïsoleerd. Andere studies in de literatuur zijn gericht op het potentieel van de totale stromale vasculaire fractie of van de bekende adipocyte progenitoren2,8,9adipogenic. Aangezien momenteel bestaande technologieën specifiek adipeus weefsel endotheliale cellen voor drug delivery10 richten kunnen, het begrip van het potentieel van dergelijke cellen ondergaan adipogenic-inductie naar wit of beige adipocytes is belangrijk voor toekomst gerichte therapieën.
Verschillende groepen gemeld de combinatie van CD31 en CD34-markeringen als surrogaten endotheliale cellen van menselijke adipeus weefsel11,12,13te isoleren. Doorgaans is de isolatie wordt uitgevoerd met behulp van twee opeenvolgende stappen en een positieve selectie met behulp van magnetische kralen. In dit verslag werd immunoseparation gebruikt CD34 + magnetische kralen gecombineerd met CD31 Kunststof kralen gebruikt. We vonden deze techniek superieur aan de sequentiële magnetische immunoseparation met betrekking tot het behoud van de typische geplaveide endothelial morfologie. Ook konden we genereren genoeg cellen die nodig zijn voor de uitbreiding en adipogenic inductie vanaf zo weinig als 1-2 g vet. De biopsie van een kleine steekproef van onderhuids vet is genoeg om de vereiste hoeveelheid cellen voor downstream toepassingen te produceren. Dit aspect is potentieel belangrijk, vooral als deze methode zal worden gebruikt voor de screening voor een alertheid op adipogenic inductie in menselijke proefpersonen.
In tegenstelling tot andere systemen gemeld in de literatuur, deze methode maakt gebruik van slechts twee ingrediënten voor de inductie van de adipogenic van de CD34 + CD31 + cellen: een agonist PPARγ — Rosiglitazon — en menselijke insuline. Nog belangrijker is, valt de hoeveelheid insuline gebruikt binnen het bereik van de normale/hoge van de circulerende post-absorptive insuline in mensen14. De mate van alertheid op insuline van de cellen in vitro, gemeten door Akt fosforylatie, doet niet correleren met hun vermogen om te reageren op de inductie cocktail. Interessant, deze inductie cocktail en experimentele voorwaarden gebruiken, een mix van witte en beige/bruin cellen werden verkregen zoals bepaald door de grootte en het aantal intracellulaire lipide druppels en de uitdrukking van moleculaire merkers. Dit eenvoudige en kosteneffectieve inductie protocol samen met de kwantitatieve beoordeling van het fenotype van de responder cellen (witte vs. beige) zorgt voor een screening van agenten die het saldo van gedifferentieerde beige potentieel kan veranderen : wit adipocytes.
Deze methode biedt ook een translationeel aanpak voor het begrip van de onderliggende mechanismen van adipogenesis van vasculaire endotheliale voorlopercellen in menselijke adipeus weefsel. Met behulp van deze specifieke isolatie/differentiatie techniek, kunnen onderzoekers verschillende trajecten verantwoordelijk voor adipogenesis in een subset van vasculaire endotheliale cellen van verschillende vet depots in mager en zwaarlijvige mensen ondervragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De focus van dit document is bedoeld als een methode voor de isolatie, de uitbreiding en de adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van viscerale en onderhuidse magazijnen van menselijke adipeus weefsel.
Methoden zijn gemeld voor de isolatie van endotheliale cellen van de verschillende vasculaire bedden van knaagdieren of mensen waarbij voornamelijk technieken met behulp van CD31 antilichamen fluorescently label of gekoppeld aan magnetische kralen18<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen erkennen Becky Marquez, de klinische coördinator op de Sentara Bariatric Center, voor haar hulp bij het proces van patiënt screening en toestemming. Dit onderzoek werd gesteund door R15HL114062 aan Anca D. Dobrian.
Materials
|
Large Equipment |
|||
|
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
