Decellularization ve Recellularization metodoloji insan safen damarlar için

Doku kullanılan ve bu kağıt Protokolü Göteborg Üniversitesi etik kuralları izler. 1. doku hazırlık ve depolama Cerrahi forseps ve makas kullanarak alınan safen ven çevre dokudan kesin.Not: Safen ven insanlar alt ekstremite damar cerrahları tarafından disseke. Bu yazıda kullanılan safen ven bypass cerrahisi sonra un kullanılan bir parçasıdır. Perfüzyon sırasında kaçağı önlemek için kendi amaçları dikişler ve forseps ile tüm yan şubelerinde ligate. Ven fosfat tampon salin (PBS) 40 mL içeren bir 50 mL tüp içinde tutun. Ven aşırı kan kaldırmak için PBS 2 – 3 kez değişiklik yaparak yıkayın. Ven-80 ° C’de dondurarak saklamak 2. Decellularization kurulumları ve Recellularization biyoreaktör hazırlanması Not: makas kullanarak, Tablo 1′ de gösterildiği gibi silikon tüpler kesti. Decellularization kurulumu 1 (Triton X-100 perfüzyon ve yıkama) Bir 2 L (plastik küvet) odası, tüp Şekil 1A’ gösterildiği gibi A tüm üç adet bant.Not: teyp nerede odası (deterjan’ın giriş) alt kenarına dokunur bir duvar için bir tüp ve diğer iki tüp ven uzunluğuna bağlı olarak 5-10 cm arasında bir mesafe ile karşı duvara. En az 5 cm Bu tüpler de odası ‘s yere (damar’ın giriş ve çıkış) bantlanmış. Erkek ve dişi radarı bağlayıcılar, kullanarak bağlan serisinde tüp için tüp B F, tüp C tüp tarafından takip deterjan’ın giriş ve sonunda damar giriş için. Yer ve peristaltik kaset tüpüne F ben pompa. Başka bir tüp C al ve bir ucunu damar’ın prize bağlayın. Diğer ucunu 45 cm (deterjan çıkış) odası yerleştirilir alt hortum çıkış ile cam kavanoza yerleştirin ve güvenliğini sağlamak için Kaydet. Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış itmek ve diğer ucunu ven odanın içine yerleştirin.Not: Tüm kurulum (kırmızı oklar), odası ve akış yönünü (beyaz ok) resimlerini Şekil 1Aile gösterilir. Decellularization kurulum 2 (için TnBP perfüzyon) 1 L cam sürahi alıp tüp jar’ın alt dokunuyor kadar tüp C (deterjan giriş) bir ucunu kavanoza yerleştirin. Tüp F tüp tarafından C. yer tüp C diğer ucunu kavanozun içine yarım Derinlik (damar’ın giriş) kadar takip için diğer ucunu bağlayın. Tüp F peristaltik pompa kaset yerleştirin ben. Tüp D alın ve bir ucu kavanoza (damar’ın çıkış) yarım derinlik ve diğer ucunu cam kavanoza kadar damar’ın giriş (deterjan çıkış) 45 cm yükseklikten yer alt hortumu ile yerleştirin. Güvenliğini sağlamak için deterjan’ın giriş ve çıkış boruları teyp. 1 L cam sürahi bir manyetik karıştırıcı yerleştirin ve mıknatıs şişe içinde tutmak. Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış üzerine itmek ve diğer ucunu 1 L cam sürahi yerleştirin.Not: Resim tam kurulumu (kırmızı oklar), Şekil 1Badımında odası ve akış yönünü (beyaz ok) gösterilir. Decellularization Kur 3 (için DNaz perfüzyon) 250 mL Cam şişe alın ve her iki ucunda da tüp C. yer tüp ortasındaki alanı peristaltik pompa II kaset yerleştirin.Not: Tüp bir ucunu çözüm giriş ve tüp diğer ucunu damar’ın koya bağlı. Damar’ın çıkış çözümde serbest bırakılır. Pompa 37 ° C’de dahil olmak üzere tüm kurulum yerleştirin Kurulumu tamamlamak ve akış yönünde resmi Şekil 1 ciçinde gösterilir. Recellularization biyoreaktör Tüm parçaları Şekil 2Agösterildiği gibi hazır tutun. Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi 4-port kapağını ve her bağlantı noktasına takın, H (damar’ın çıkış) Tüp, tüp ben (medya giriş) ve J (damar’ın giriş) tüp. Tüp H diğer ucunu (medya çıkış) 4th bağlantı noktasına bağlayın.Not: 4-port kapağı üstten görünüm Şekil 2Ciçinde gösterilir. Tüpler, sivri bir makas ile kenarları kesilmiş kolay ekleme için. Diğer ucunu ise tüp J U şekle viraj ve dikiş ile kravat. Azalan bakiyeli bağlayıcılar tüpler H & J. iç ucuna bağlayın 60 mL tüp düz taban ile 250 mL Cam şişe içine yerleştirin ve yukarıda yapılan Kur Şekil 2Bolarak gösterildiği gibi tüp içine yerleştirin. Şekil 2Eiçinde gösterildiği gibi tüplerde K, E ve K serisi bağlayın. Bir tüp K damar’ın giriş ve medya giriş için başka bir tüp K bağlayın.Not: Kurulum ve akış yönü Şematik diyagramı Şekil 2Fiçinde görülür. Biyoreaktör tarafından ısıyla sterilize. 3. hazırlık çözümleri Çözüm 1 (10 x su): için 1 L Ultrasaf Su, 2 g sodyum azid ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 18.6 g ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın. Çözüm 2 (1 x su): 100 mL çözeltisi 1 alın ve 900 mL ultrasaf su ekleyin. Çözüm 3 (Triton X-100 x 5): Triton X-100 50 mL, 1 g sodyum azid ve 9.3 g EDTA Ultrasaf Su 950 mL için ekleyin. Eriyene kadar karıştırın. Çözüm 4 (Triton X-100 x 1): 200 mL çözüm 3 alın ve 800 mL ultrasaf su ekleyin. Çözüm 5 (1 x TnBP): TnBP 10 mL 10 mL pipet ile çözüm 2 990 mL için ekleyin. Çözüm 6 (40 Kunitz adet/mL DNaz): DNaseI, 2.000 Kunitz eklemek biriminde Dulbecco’nın fosfat tampon CaCl2 ve MgCl2içeren serum 50 mL. Taze hazırlamak ve hemen kullanın. Çözüm 7 (PBS): 24 g sodyum klorür, potasyum klorür 0.6 g, 4,32 g sodyum fosfat ve potasyum fosfat 0,72 g için 3 L ultrasaf su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın. PH 7.4 için ayarlayın. 1 litre PBS Otoklav içinde sterilize ve ayrı ayrı saklayın. Çözüm 8 (% 0,1 Perasetik asit): 50 mL steril çözüm 7, 50 µL Perasetik asit ekleyin. Taze hazırlamak ve hemen kullanın. 4. endotel orta hazırlanması L-glutamine, 5 mL 5 mL anti-anti, insan AB serumu 50 mL ve 500 ml steril bir başlık altında MCDB131 orta fetal Sığır serum dışında EGM-2 büyüme faktörü kitinin tüm bileşenleri de ekleyin. 5. safen ven decellularization İnsan safen ven-80 ° c oda sıcaklığında erimek. Tekrar-80 ° C’de donmasına ve yine oda sıcaklığında erimek. Biyopsi makas kullanarak 2 mm uzunlukta Kes ve formaldehit oda sıcaklığında 24-48 h için düzeltin. Damar dikiş ile erkek ve dişi radarı bağlayıcı barbs için her iki ucuna bağla. Ven decellularization Kur 1 bağlanmak ve çözüm 2 1 litre doldurun. 15 dk 35 mL/dak., boş için kurulum içeriğini sıvı. Çözüm 4 1 litre ekleyin ve 4 35 mL/dak. s kurulum içeriğini boşaltmak için sıvı. Çözüm 2 500 mL ekleyin ve 5 dk. boş için kurulum içeriğini sıvı. Bu adımı yineleyin. Ven perfüzyon kurulumundan 1 çıkarıp perfüzyon kurulum 2 takın. Çözüm 5 1 litre ekleyin, karıştırıcı üzerinde açmak ve 35 mL/dk 4 h için sıvı.Not: Çözüm 5 dönüm karıştırıcı ve perfüzyon boyunca sonra bulanık. Ven perfüzyon kurulumundan 2 kesin ve 5-10dk Ultrasaf Su 4 değişiklikleri damar’ın iç ve dış şırınga veya 10 mL pipet ile yıkayın. Perfüzyon Kur 3 damar bağlanmak, çözüm 6 50 mL ekleyin ve 10 mL/dk 37 ° C odasında 4 h kurulum içeriğini boş ve damar kurulumundan kesmek için sıvı. Ven perfüzyon Kur 1 bağlanmak, çözüm 2 1 litre doldurmak ve gecede 35 mL/dak. tekrarlamak adım 5.4 ile adım 5,9 4 kez (için toplam 5 döngüleri), sıvı. Adım 5.2 belirtildiği gibi tekrar biyopsi alın.Not: Atla adım 5.8 ikinci bölümü döngülerle 1 ve 3. Belgili tanımlık tertibat içeriğini temizleyin. Çözüm 2 1 litre doldurun ve sıvı 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için 2’den sonra 12 h. Kur içeriğini temizleyin. 1 L ultrasaf su doldurun ve 35 mL/dak değişiklik Ultrasaf Su 24 h için kurulum içeriğini sonra 12 h.Empty sıvı. Çözüm 7 1 L doldurun ve sonra 12 saat 7 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için sıvı. 6. Decellularization doğrulanması Biyopsi standart protokolleri takip bir doku işlemci işlem 15 dakika süreyle Ultrasaf Su sabit formalin yıkayın ve parafin22embed. Bir microtome kullanma 5 µm bölümlerine kesmek ve leke Meyer Hematoksilen ve % 0,2 alkollü eozin (H & E) ile aşağıdaki standart protokolleri22. Çekirdekler için normal doku karşılaştırıldığında decellularized doku kaybı olup olmadığını denetlemek için mikroskop altında görüntüleyin. 7. recellularization Ven çözüm 8 50 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirerek sterilize. Shaker 37 ° C’de 1 h için (devir/dakika) dakikada 80 rotasyonlar, kışkırtmak Laminar akış (SMD) andan itibaren kısırlık korumak için kabin altında ven başa. 50 mL steril çözüm 7 ve 500 µL anti-anti, içeren yeni bir 50 mL tüp için steril forseps kullanarak ven aktarın. Yukarıdaki gibi 12 h. değişiklik çözüm 7 en az iki kez arasında için tahrik. Steril forseps kullanarak, yeni bir 50 mL tüp ven aktarmak ve endotel medya 50 mL ekleyin. Yukarıdaki gibi 11 h için tahrik. SMD Kabin altında steril eldiven kullanarak biyoreaktör bir araya getirin. Ven biyoreaktör’ın damar giriş ve çıkış steril dikiş ve forseps ile için kravat. Ven biyoreaktör ve dolgu aynı orta ile bağlayın. 50 IU/mL heparin ekleyin ve 2 mL/dk 37 ° c 1 h için sıvı Heparin kaplı tüp tüpler donörden 15-25 mL taze kan (bağlı olarak damar’ın uzunluğu) toplamak ve Steen çözüm ile 1:1 oranında seyreltin. Daha sonra endokrin bezi kaynaklı vasküler endotelyal büyüme faktörü (EG-VEGF, 80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-b, 4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL) ekleyin. 37 ° C kuluçka %5 CO2 biyoreaktör taşımak ve 2 mL/dk 48 h için sıvı. Yaklaşık 12 h sonra biyoreaktör bir LAF dolap, hareket bir damla kan al ve kullanarak izleme cihazı bir kan şekeri glukoz ölçümü. Düzeyi daha az 3 mmol/L ise, glikoz getirmek için eklemek 7-9 mmol/l yineleme aralığı içinde bu adım her 8-12 h. 48 h sonra biyoreaktör LAF kabin taşımak ve biyoreaktör kandan drenaj. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. drenaj çözüm sıvı. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. tekrar iki kez veya kan kırmızı renk kaybolur kadar sıvı.Not: Hücre ek doğrulama için biyopsi alınabilir. Damarı kesmek, ven 5 mm kenarları makasla kesmek ve onları atın. 5.2. adımda belirtildiği gibi bir biyopsi almak ve damar yeniden biyoreaktör (isteğe bağlı adım) bağlanın. Endotel orta 30-45 mL ekleyin ve 2 mL/dk kuluçka 96 h için sıvı.Not: endotel orta damarı batık kadar ekleyin. Biyoreaktör LAF kabinin taşımak, recellularized damar bağlantısını kesin, makas kullanarak ven 5 mm kenarları kesilmiş ve atmak. Biyopsi 5.2. adımda belirtilen şekilde alın. 8. Recellularization doğrulanması 6 bölümündeki yönergeleri izleyin ve H & E boyama gerçekleştirmek. Slaytları hücrelerin varlığı için mikroskop altında incelemek.