Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法

組織を使用し、本稿のプロトコル ヨーテボリ大学の倫理ガイドラインに従います。 1. ティッシュの準備・ 手術用鉗子、はさみを使用して取得した大伏在静脈から周囲の組織をカットします。注: 大伏在静脈は、血管外科医による人間の下肢から解剖しました。このペーパーで使用される大伏在静脈は、バイパス手術後の未利用部分です。 血流中に漏れを防止するには、縫合鉗子と彼らの両端にすべての側枝を縛る。 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) の 40 mL を含む 50 mL のチューブに静脈をしてください。余分な血液を削除する PBS 2 – 3 回を変更することにより、静脈を洗います。-80 ° C で凍結による静脈を格納します。 2. Decellularization のセットアップと Recellularization バイオリアクターの準備 注: は、はさみを使用して、表 1に示すように、シリコン チューブをカットします。 Decellularization セットアップ 1 (トリトン X-100 灌流、洗浄) 2 L にチャンバー (プラスチック製の浴槽)、管 A図 1 aに示すように、すべての 3 つの小品をテープします。注: テープの端が商工会議所 (洗剤の入口) の底に触れる 1 つの壁に 1 つの管と静脈の長さに応じて間に 5-10 cm の距離で反対側の壁には、他の 2 つの管。これらのチューブの少なくとも 5 cm は、商工会議所の床 (静脈の入口と出口) にも録音必要があります。 洗剤の流入管に管 B 管 F 管 C 続くシリーズの接続男女別ルアー コネクタを使用して、最終的に静脈入口に。場所 F、蠕動のカセットに挿入するチューブ ポンプ私です。 別チューブ C に乗り、静脈の出口に 1 つの端を接続します。商工会議所 (洗剤アウトレット) 直上の 45 cm は下ホース コンセント付きのガラス瓶にもう一方の端を置き、それを確保するためのテープします。チューブ G に乗り、ガラス瓶のホース コンセントに一方の端をプッシュし、静脈チャンバーにもう一方の端を配置します。注: セットアップを完了 (赤矢印)、商工会議所、及び流れ方向 (白い矢印) の写真は、図 1 aのとおりです。 Decellularization セットアップ 2 (TnBP の灌流) 1 L のガラス瓶を持ってし、管瓶の底に触れるまで、瓶にチューブ C (洗剤入口) の一方の端を配置します。 管 F の半分の深さ (静脈の入口) まで瓶に C. 場所管 C のもう一方の端をチューブで後にもう一方の端を接続します。蠕動ポンプのカセットに F 管を置く私。 管 D を取るし、静脈の入口 (洗剤コンセント) から 45 cm の高さで置かれた下ホースで半分の深さとガラス瓶の中にもう一方の端まで瓶 (静脈の出口) に 1 つの端に置きます。確保するために洗剤の入口と出口の管をテープします。 磁性攪拌器に 1 リットルのガラス瓶を置き、磁石が我慢してボトル。 チューブ G に乗り、ガラスの瓶のホース口に片方の端をプッシュし、1 L のガラス瓶にもう一方の端を配置します。注: 画像の完全なセットアップ (赤矢印)、商工会議所および流れの方向 (白い矢印) は図 1 bに示すように。 Decellularization セットアップ 3 (DNase の灌流) 250 mL の瓶を取るし、蠕動性ポンプ II のカセット チューブ C のイス チューブの中間領域の両端に配置。注: チューブの一方の端は液入口、静脈の流入する管のもう一方の端を接続します。静脈の出口はソリューションで無料になっています。 37 ° C でポンプを含む全体のセットアップを場所します。セットアップを完了し、流れ方向の写真を図 1に示します。 Recellularization バイオリアクター 準備ができた保つすべての部品図 2 aに示すように。 図 2 bに示すように 4 ポート キャップを取ると各ポートに挿入、H (静脈の出口) をチューブ、チューブの私 (メディア入口)、J (静脈の入口) をチューブします。4番目のポート (マスコミ) 管 H のもう一方の端に挿入します。メモ: 4 ポート キャップの上からのビューは、図 2に示されています。簡単にハサミで鋭いポイントに端をカット、チューブの挿入。 U 形に J ・ チューブのもう一方の端を曲げ、縫合糸でそれを縛る。H & j. チューブの内側の両端に削減コネクタを接続します。 250 mL ガラス瓶の中にフラット ベース 60 mL チューブを置き、図 2 Dに示すように管に上記したセットアップを配置します。図 2 eのように、K、E、および K の管シリーズに接続します。静脈の入口に 1 つ管 K と別の管 K メディア入口に接続します。注: セットアップ、及び流れ方向の回路図は、図 2 階に見られます。 バイオリアクターをオートクレーブで滅菌します。 3. 溶液の調製 解決策 1 (10 x 水): 1 L の純水には 2 g のアジ化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 18.6 g を追加。塩が溶けるまでかき混ぜます。 解決策 2 (1 x 水): 100 mL の溶液 1 を取るし、純水の 900 mL を追加。 解決策 3 (トリトン X-100 x 5): 純水 950 mL に EDTA の 9.3 g、1 g、アジ化ナトリウムのトリトン X-100 の 50 mL を追加。溶解するまで攪拌します。 ソリューション 4 (トリトン X-100 x 1): 200 mL の溶液 3 を取るし、純水の 800 mL を追加。 解決方法 5 (1 x TnBP): 990 溶液 2 mL を 10 mL のピペットと TnBP の 10 mL を追加。 解決策 6 (40 Kunitz 単位/ml DNase): ダルベッコ リン酸バッファー食塩 CaCl2と MgCl2を含む 50 ml DNaseI の追加 2,000 Kunitz ユニット。新鮮な準備し、すぐに使用します。 解決策 7 (PBS): は、純水の 3 L にリン酸カリウムの 0.72 g、リン酸ナトリウムの 4.32 g 0.6 g の塩化カリウムの塩化ナトリウム 24 g を追加します。溶解するまで攪拌します。7.4 に pH を調整します。滅菌オートクレーブで PBS の 1 L とは別々 に保管します。 ソリューション (0.1% 過酢酸) 8: 7 の無菌溶液の 50 mL に酢酸の 50 μ L を追加。新鮮な準備し、すぐに使用します。 4. 内皮媒体の作製 L-グルタミンの 5 mL の 5 mL 対策、AB 血清の 50 mL と 500 mL 無菌フードの下で MCDB131 中に牛胎児血清を除く EGM 2 成長因子キットのすべてのコンポーネントを追加します。 5. 伏在静脈の decellularization 室温で-80 ° C からひと伏在静脈を解凍します。-80 ° C で再度凍結し、再び室温で解凍。 はさみを使用して 2 mm の生検をカットし、室温で 24-48 h のホルムアルデヒドで修正します。縫合糸と男性と女性のルアーロック コネクタの棘に静脈の両端を結ぶ。 Decellularization セットアップ 1 に静脈を接続し、解決策 2 の 1 L を入力します。35 mL/分で 15 分空のセットアップの内容のために灌流します。 解決策 4 の 1 L を追加し、セットアップの内容を空に 4 h 35 mL/分での灌流します。 500 mL の溶液 2 を追加し、5 分設定の内容を空の灌流します。この手順を繰り返します。灌流セットアップ 1 から静脈を切断し、灌流セットアップ 2 に接続します。 解決策 5 の 1 L を加えてかくはんオン 35 mL/分で 4 時間灌流します。注: 解決方法 5 は回転かくはんおよび灌流全体で後曇りに見えます。 灌流セットアップ 2 から静脈を切断し、5-10 分の超純水の 4 変化で静脈の外側と内側のシリンジに 10 mL のピペットを洗います。 灌流セットアップ 3 静脈に接続ソリューション 6 の 50 mL を追加して、4 h、セットアップの内容を空にして、セットアップから静脈を切断の 37 ° C 室 10 mL/分で灌流します。 接続静脈灌流セットアップ 1、解決方法 2 の 1 L を記入の 35 mL/分ステップ 5.9 4 回 (合計 5 サイクル) を繰り返しステップ 5.4 で一晩を灌流しました。手順 5.2 で示されたとして再度生検を取る。注: スキップのステップ 1 と 3 のサイクルで 5.8 の 2 番目の部分。 セットアップの内容を空にします。解決方法 2 の 1 L を記入し、灌流 35 mL/分変更ソリューションで 24 h の 12 h. 後 2 空のセットアップの内容。超純水水 1 リットルを記入し、12 h.Empty 後、セットアップの内容変更超純水水 35 mL/分で 24 時間灌流します。解決策 7 の 1 L を記入し、7 後 12 h 35 mL/分変更ソリューションで 24 時間灌流します。 6. Decellularization の検証 ホルマリン固定ティッシュ プロセッサ標準プロトコルを次の 15 分プロセスの純水で生検を洗浄し、パラフィン22に埋め込みます。 ミクロトームを使用して 5 つの μ m のセクションをカットし、マイヤーのヘマトキシリンと 0.2% アルコール エオシン (H & E) 染色標準プロトコル22。 正常組織と比較して脱組織における核の損失を確認する顕微鏡の下でを表示します。 7. recellularization 50 mL の溶液 8 を含む 50 mL のチューブに置くことで静脈を滅菌します。37 ° C で 1 h のシェーカーで 80 回転/分 (rpm) で扇動します。 層流 (LAF) 無菌性を維持にキャビネットの下静脈を処理します。対策の滅菌溶液 7 と 500 μ L の 50 mL を含む新しい 50 mL チューブ滅菌用のピンセットを使用して静脈を転送します。12 h. 変更ソリューション 7 間に少なくとも 2 回の上記のように揺り動かします。 滅菌鉗子を使用して、新しい 50 mL のチューブに静脈を転送し、内皮メディアの 50 mL を追加します。11 h については、上記を揺り動かしなさい。 キャビネットの LAF の下で滅菌手袋を使用してバイオリアクターを組み立てます。バイオリアクターの静脈入口と滅菌縫合鉗子と出口に静脈を結ぶ。 バイオリアクターと同じ培地で塗りつぶし、静脈に接続します。50 IU/mL にヘパリンを追加し、37 ° C で 2 mL/分で 1 時間灌流 ヘパリン コーティング バキュテナー チューブでドナーから 15 25 mL (静脈の長さ) に応じて新鮮な血液を収集し、スティーン ソリューションと 1:1 の希釈します。その後、内分泌腺由来血管内皮増殖因子 (VEGF EG、80 ng/mL)、塩基性繊維芽細胞成長因子 (B-FGF、4 μ L/mL) とアセチル ・ サリチル酸 (5 μ G/ml) を追加します。 バイオリアクターを 5% CO2と 37 ° C の定温器に移動し、2 mL/分で 48 時間灌流します。 約 12 時間後、バイオリアクターに移動キャビネット、LAF 血のドロップを取るし、血糖監視装置を用いたグルコースを測定します。レベルが 3 以内のモル/L の場合追加をもたらすブドウ糖 7 9 ミリ モル/L の繰り返しの範囲でこのステップごとの 8-12 h。 48 時間後キャビネットの LAF にバイオリアクターを移動し、バイオリアクターから血液を排出します。滅菌溶液 7 30 mL を加えて 5 分排水ソリューションを灌流します。30 mL の滅菌溶液 7 を追加し、2 回以上血の赤い色がなくなるまで 5 分繰り返し灌流します。注: 生検は細胞接着の確認のため撮影できます。静脈を外し、静脈の 5 mm 端をハサミで切って捨てます。5.2 の手順で述べたように、生検を取る、バイオリアクター (オプションの手順) 静脈を再び接続します。 内皮細胞培地の 30-45 mL を追加し、2 mL/分でインキュベーターで 96 時間灌流します。注: は、静脈が水没するまでに内皮細胞培地を追加します。 LAF のキャビネットに、バイオリアクターを移動、recellularized の静脈を切断、はさみを使用して静脈の 5 mm の縁を切って、破棄します。5.2 の手順で述べたように、生検を取る。 8. Recellularization の検証 セクション 6 の指示に従い、H & E 染色を行います。細胞の存在を顕微鏡でスライドを確認します。