Summary

Differensiering, vedlikehold og analyse av menneskelig netthinnens Pigment epitel celler: en sykdom-i-en-fat modell for BEST1 mutasjoner

Published: August 24, 2018
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å skille netthinnens pigment epitel (RPE) celler fra menneskelige pluripotent stamceller bærer pasient-avledede mutasjoner. De muterte cellelinjer kan brukes for funksjonell analyser inkludert immunoblotting, immunofluorescence og patch klemme. Denne sykdommen-i-en-fat omgår vanskelighetene med å skaffe innfødt menneskelige RPE celler.

Abstract

Selv om over 200 genetiske mutasjoner i menneskelig BEST1 genet har blitt identifisert og knyttet til netthinnens degenerative sykdommer, forblir patologisk mekanismer unnvikende skyldes i hovedsak mangel på en god i vivo modell for å studere BEST1 og dens mutasjoner under fysiologiske forhold. BEST1 koder en ion kanal, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), som fungerer i netthinnens pigment epitel (RPE); men representerer svært begrenset tilgang til innfødte menneskeceller RPE en stor utfordring for vitenskapelig forskning. Denne protokollen beskriver hvordan å generere menneskelige RPEs bærer BEST1 sykdom-forårsaker mutasjoner av indusert differensiering fra menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs). Som hPSCs er selv fornybar, denne tilnærmingen lar forskere har en jevn kilde til hPSC-RPEs for ulike eksperimentelle analyser, som immunoblotting, immunofluorescence og patch klemme, og dermed gir en svært kraftig sykdom-i-en-fat modell for BEST1-forbundet retinal forhold. Spesielt kan denne strategien brukes for å studere RPE (patho) fysiologi og andre gener rundt innfødt uttrykt i RPE.

Introduction

Det er dokumentert at minst fem netthinnens degenerative sykdommer er forårsaket av genetiske mutasjoner i BEST1 gen1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, med antall rapporterte mutasjoner allerede over 200 og fortsatt økende. Disse BEST1-tilknyttede sykdommer, også kjent som bestrophinopathies, forårsake progressive synstap og med blindhet, og det finnes ingen effektiv behandling. Protein produktet av BEST1, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), er en Ca2 +-aktivert Cl kanal (CaCC) spesielt uttrykt i netthinnens pigment epitel (RPE) øyne5,6, 8,9. Viktigst, en klinisk fenotypen av BEST1-tilknyttede sykdommer er redusert visuelle svaret lett stimuli, kalt lys peak (LP) målt i electrooculogram10,11; LP antas å være formidlet av en CaCC i RPE12,13,14. For å bedre forstå patologisk mekanismer for BEST1 mutasjoner og arbeide mot potensielle terapi, er det viktig å studere mutant BEST1 kanaler endogenously uttrykt i menneskelig RPE celler.

Men å skaffe RPE celler direkte fra live pasienter er svært upraktisk. Selv om opprinnelig RPE celler kan høstes fra biopsies av menneskelige levningene og fostre, grenser vanskelig tilgang til disse kildene betydelig forskning. Derfor er det avgjørende å ha alternative RPE kilder enn menneskelige øyne. Denne samtalen er blitt besvart av nylige fremskritt i stamcelleforskningen teknikker, funksjonelle RPE celler kan nå være differensiert fra menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs), inkludert embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), sistnevnte blir generert av omprogrammering primære hud fibroblaster givere16,17,18. Viktigere, sikre selvtillit fornyelse og pluripotency av hPSCs en pålitelig kilde for å generere RPEs, mens pasienten-spesifisiteten av hiPSCs og genomisk endring potensialet i hESCs (f.eksved CRISPR) tilbyr en allsidig sykdom-i-en-fat modell for ønsket BEST1 mutasjoner.

hPSC-RPE har flere fordeler sammenlignet med mus RPE modeller: 1) BEST1 knockout mus viser ikke noen retinal abnormitet19, øke muligheten for ulike genetisk krav av BEST1 i RPE mellom mus og mennesker; 2) bare 3% av menneskelige RPE celler er binucleate, i motsetning til 35% i mus20; 3) hiPSC-RPE potentiates autolog transplantasjon i klinisk behandling av retinal lidelser21. Likevel dyremodeller er fortsatt uunnværlig for å studere RPE fysiologi og patologi i et live system, og kreftfremkallende potensialet i hiPSC ikke kan overses.

Fremgangsmåten her beskriver en nyttig og moderat enkel hPSC RPE differensiering protokollen som kan brukes for forskning og klinisk. Denne protokollen bruker nikotinamid (vitamin B3) å styrke differensiering av hPSCs til nevrale vev, som er videre indusert å differensiere i RPE av behandling med activin-A. Nikotinamid behandling har vist seg å øke antall pigmentert celler (et tegn på differensiering inn RPE), muligens av demping apoptotisk aktiviteten skille celler22. De resulterende hPSC-RPE-cellene vise samme viktige indikatorer, brosteinsbelagte morfologi og cellulære funksjoner som innfødt menneskelige RPE celler22. Dermed i en forskning er de resulterende hPSC-RPE-cellene egnet for nedstrøms funksjonelle analyser inkludert immunoblotting, immunostai- og hele celle oppdateringen klemme, som detaljert eksperimentelle prosedyrer tilbys også. Klinisk har RPE celler avledet fra stamceller vist stort potensial for transplantasjon behandling av makuladegenerasjon i både dyrestudier og menneskelige studier23.

Protocol

1. differensiering av hPSC til RPE Opprettholde og passasje hPSCs som tidligere beskrevet18.Merk: Alle celler (inkludert hPSCs og hPSC-RPEs) er dyrket i 37 ° C på 5% CO2 hele varigheten av vekst og differensiering protokoller. Før differensiering, delt confluent hPSCs til pre belagt 6-og plater. Pels plater, tine kjelleren membran matrise på isen i ca 1 time, suspendere liquidized matrise i 4 ° C DMEM medium på en 1:50 fortynning…

Representative Results

Det mest teknisk utfordrende trinnet er Manuell isolasjon, som har som mål å oppnå høy renhet av differensiert P0 hPSC-RPE innbyggere. Etter en vellykket isolasjon, > 90% celler i befolkningen P0 vil vokse og modnes vise signatur RPE morphologies (figur 1 c). Eksistensen av en mindre del av ikke-RPE eller umodne RPE celler i befolkningen P0 er nesten uunngåelig, men forstyrre ikke nedstrøms eksperimenter så lenge antall…

Discussion

Viktigste prosedyren for sykdom-i-en-fat tilnærming er å skille hPSCs med en sykdom-forårsaker mutasjon i riktig celle arverekken, som er RPE for BEST1. Dermed etter hver differensiering eksperiment, bør de resulterende hPSC-RPE-cellene nøye validert sin eldre status RPE-spesifikke morphologies og protein markører16,17,18. For å minimere klonal gjenstand, bør flere hiPSC kloner fra samme pasient eller flere hESC…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prosjektet ble finansiert ved NIH tilskudd EY025290, GM127652 og Universitetet i Rochester oppstart finansiering.

Materials

Knock-Out (KO) DMEM ThermoFisher 10829018
KO serum replacement ThermoFisher 10829028
Nonessential amino acids ThermoFisher 11140050
Glutamine ThermoFisher 35050061
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 10378016
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Human activin-A PeproTech 120-14
MEM (a modification) Sigma-Aldrich M4526
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
N1 supplement Sigma-Aldrich N6530
Glutamine-penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich G1146
Nonessential amino acids Sigma-Aldrich M7156
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0386
Triiodo-thyronin Sigma-Aldrich T5516
mTeSR-1 medium Stemcell Technologies 5850
Matrigel Corning 356230
Collagenase Gibco 17104019
Trypsin VWR 45000-664
M-PER mammalian protein extraction reagent Pierce 78501
proteinase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
RPE65 antibody Novus Biologicals NB100-355
CRALBP antibody Abcam ab15051
BEST1 antibody Novus Biologicals NB300-164
Beta Actin antibody ThermoFisher MA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG ThermoFisher A-21202
Goat anti-mouse IgG ThermoFisher SA5-35521
Goat anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-68071
Hoechst 33342 ThermoFisher 62249
HEKA EPC10 patch clamp amplifier Warner Instruments 895000
Patchmaster Warner Instruments 895040

References

  1. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
  2. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
  3. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
  4. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
  5. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
  6. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
  7. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
  8. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
  9. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
  11. Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
  12. Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
  13. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
  14. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  15. Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
  16. Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
  17. Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
  18. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
  19. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
  20. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
  21. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  22. Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  23. Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  24. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  25. Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
  26. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
  27. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
  28. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
  29. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
  30. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
  31. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  32. Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
  33. Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).

Play Video

Cite This Article
Kittredge, A., Ji, C., Zhang , Y., Yang, T. Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations. J. Vis. Exp. (138), e57791, doi:10.3791/57791 (2018).

View Video