Differentiering, vedligeholdelse og analyse af menneskers retinale Pigment epitel celler: en sygdom i skål Model for BEST1 mutationer
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at differentiere retinale pigment epitel (ÅV) celler fra humane pluripotente stamceller forsynet med patienten-afledte mutationer. De mutante cellelinjer kan anvendes til funktionelle analyser herunder immunoblotting, immunofluorescens og patch klemme. Denne sygdom i parabol fremgangsmåde omgår vanskeligheden ved at opnå indfødte ÅV menneskeceller.
Abstract
Selv om over 200 genetiske mutationer i det menneskelige gen, BEST1 er blevet identificeret og knyttet til retinal degenerative sygdomme, fortsat de patologiske mekanismer undvigende hovedsagelig på grund af manglen på en god i vivo model til at studere BEST1 og dens mutationer fysiologiske betingelser. BEST1 koder en ion-kanal, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), som fungerer i retinale pigment epitel (ÅV); imidlertid udgør meget begrænset adgang til native ÅV menneskeceller en stor udfordring for videnskabelig forskning. Denne protokol beskriver hvordan man kan generere menneskelige RPEs forsynet med BEST1 sygdomsforårsagende mutationer af inducerede differentiering fra humane pluripotente stamceller (hPSCs). Som hPSCs er selvstændige vedvarende, denne fremgangsmåde gør det muligt for forskere at have en konstant kilde til hPSC-RPEs for forskellige eksperimentelle analyser, såsom immunoblotting, immunofluorescens og patch clamp, og dermed giver en meget kraftfuld sygdom i skål model for BEST1-forbundet retinal betingelser. Denne strategi kan især anvendes til at studere ÅV (patho) fysiologi og andre gener af interesse indbygget udtrykt i ÅV.
Introduction
Det er blevet dokumenteret at mindst fem retinal degenerative sygdomme er forårsaget af genetiske mutationer i BEST1 genet1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, med antallet af rapporterede mutationer allerede over 200 og stadig stigende. Disse BEST1-associerede sygdomme, også kendt som bestrophinopathies, forårsage progressiv synstab og endda blindhed, og der er i øjeblikket ingen effektive behandlinger. Protein produkt af BEST1, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), er en Ca2 +-aktiverede Cl– kanal (CaCC) specifikt kommer til udtryk i den retinale pigment epitel (ÅV) øjne5,6, 8,9. Vigtigere er, en klinisk Fænotypen af BEST1-associerede sygdomme er den reducerede visuelle reaktion på lys stimuli, kaldet light peak (LP) målt i electrooculogram10,11; LP menes at være medieret af en CaCC ÅV12,13,14. For at bedre forstå de patologiske mekanismer af BEST1 mutationer og arbejde hen imod potentielle terapier er det vigtigt at studere mutant BEST1 kanaler endogent udtrykt i ÅV menneskeceller.
Men, at opnå ÅV celler direkte fra live patienter er meget upraktisk. Selvom indfødte ÅV celler kan høstes fra biopsier af menneskelige kadavere og fostre, begrænser vanskelig adgang til disse kilder væsentligt videnskabelig forskning. Derfor er det afgørende at have alternative ÅV kilder end menneskers øjne. Dette opkald er blevet besvaret af de seneste fremskridt i stamceller teknikker, som funktionelle ÅV celler kan nu differentieres fra humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), sidstnævnte der genereres af omprogrammering primære hud fibroblaster fra donorer16,17,18. Vigtigere, sikrer selvfornyelse og pluripotency af hPSCs en pålidelig kilde for at generere RPEs, mens patienten-specificiteten af hiPSCs og genomisk ændring potentiale af hESCs (f.eks.af CRISPR) tilbyder en alsidig sygdom i skål model for ønskede BEST1 mutationer.
hPSC-RPE har flere fordele sammenlignet med mus ÅV modeller: 1) BEST1 knockout mus ikke vise nogen retinal abnormitet19, at øge muligheden for forskellige genetiske kravet om BEST1 i ÅV mellem mus og mennesker; 2) kun 3% af ÅV menneskeceller er binucleate, i modsætning til 35% i mus20; 3) hiPSC-RPE potentiates autolog transplantation i klinisk behandling af retinal lidelser21. Ikke desto mindre dyremodeller er stadig nødvendig for at studere ÅV fysiologi og patologi i et levende system, og det muterede potentiale i hiPSC ikke blive overset.
Proceduren her beskriver en nyttig og moderat enkle hPSC til ÅV differentiering protokol, der kan bruges til forskning og kliniske formål. Denne protokol bruger nicotinamid (vitamin B3) til at forøge differentiering af hPSCs til neurale væv, som yderligere er foranlediget til at differentiere i ÅV ved behandling med activin-A. Nicotinamid behandling har vist sig at øge antallet af pigmenterede celler (et tegn på differentiering af ÅV), muligvis af formildende apoptotiske aktivitet at skelne celler22. De resulterende hPSC-RPE celler vise samme nøgle markører, brostensbelagte morfologi og cellulære funktioner som indfødte menneskelige ÅV celler22. Således i forskning omgivelser er de resulterende hPSC-RPE celler egnet til downstream funktionelle analyser herunder immunoblotting, immunfarvning og hele-celle patch clamp, som detaljeret eksperimentelle procedurer er også til rådighed. Klinisk, har ÅV celler fremstillet af stamceller vist stort potentiale for transplantation behandling af makuladegeneration i både dyreforsøg og human forsøg23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den vigtigste procedure til sygdom i parabol tilgang er at skelne hPSCs med en sygdomsfremkaldende mutation til den korrekte celle afstamning, som er ÅV for BEST1. Således, efter hver differentiering eksperiment, de deraf følgende hPSC-RPE celler skal omhyggeligt valideres for deres modne status af ÅV-specifikke morfologier og protein markører16,17,18. For at minimere klonede artefakt, bør flere hiPSC kloner fra d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud EY025290, GM127652 og University of Rochester start-up finansiering.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
