Гипофиза является ключевым эндокринного органа в позвоночных расположен ниже гипоталамуса и кзади зрительных нервов. Она производит и выделяет гормоны, шесть-восемь из типов конкретных клеток. Гормоны гипофиза являются промежуточным между мозга и периферических органов и управлять широкий спектр основных физиологических процессов, включая рост, размножение и регуляции гомеостаза. Подобно нейронов, эндокринных клеток гипофиза электрически возбудимых с возможностью спонтанно огонь потенциалы действия ¹. Роль этих действий потенциалов является зависимой ячейки. В нескольких типах клеток млекопитающих гипофиза потенциалы действия может поднять внутриклеточных Ca^{2 +} достаточно для стабильного выпуска гормона ². Кроме того гипофиза получает как стимулирующее, так и тормозящий информацию от головного мозга, которое затрагивает мембранного потенциала клеток ^3,4,5,6. Как правило стимулирующее ввода увеличивает возбудимость и часто включает в себя выпуск Ca^{2 +} от внутриклеточного магазинов а также увеличилась, выпустив частоты ⁷. Понимание как ячейка использует канал ионного состава и приспосабливается к этим входных сигналов от мозга является ключом к пониманию синтез гормонов и выпуска.

Патч зажим техника была разработана в конце 70-х годов Сакман и Неер ^8,9,10 и дальнейшего улучшения Хэмилл ¹¹и позволяет детальные исследования электрофизиологических свойств клеток вплоть до одного ионных каналов. Кроме того этот метод может использоваться для изучения тока и напряжения. Сегодня патч зажима является золотым стандартом для измерения электрофизиологических свойств ячейки. Четыре основных конфигураций герметичное уплотнение патч зажим техники были развитые ¹¹; клетки придает, изнутри наружу, снаружи out и поклеточного патч. Три первых конфигурации обычно используются для одной ионного канала расследований. Четвертое, после придает ячейки конфигурации отверстие в клеточной мембраны производится с использованием югу атмосферного давления. Эта конфигурация также позволяет исследования ионного канала состава клеточных ¹². Однако одним ограничением этой методики является, что цитоплазматических молекулы разводят патч пипеткой решение ¹³ (рис. 1А), влияя таким образом на электрических и физиологические реакции исследованных клеток. Действительно некоторые из этих молекул может играть важную роль в трансдукции сигнала или в регуляции различных ионных каналов. Чтобы избежать этого, Линдау и Фернандес ¹⁴ разработал метод где поры формирование соединения добавляется к патч пипеткой. После конфигурации придает ячейки соединение будет включать в плазматической мембраны под патч и медленно перфорировать мембраны, создание электрического контакта с цитозоле (рис. 1Б). Можно использовать несколько различных противогрибковые препараты, такие как нистатин ¹⁵ и амфотерицин B ¹⁶, или поверхностно-активных веществ, как сапонины бета эсцин ^17,18 . Эти соединения создают поры достаточно большой, чтобы позволить моновалентной катиона и Cl^– диффузии между цитозоле и патч пипеткой при сохранении цитозольной уровни макромолекул и больше ионов как Ca^{2 + 15, 16}.

Проблема использования перфорированной патч является потенциально высокой серии сопротивление. Последовательное сопротивление (R_s) или доступ сопротивление является комбинированных сопротивления над патч пипеткой по отношению к земле. Во время записи патч зажим, R_s будет параллельно с мембраной сопротивления (R_m). _M R и R_s в параллельной работы как Делитель напряжения. С высокой R_s, напряжение упадет R_s давая ошибки в записи. При больших токах Записанная ошибка станет больше. Кроме того делителя напряжения является частота зависит от создания НЧ-фильтр, таким образом затрагивающих временное разрешение. По сути перфорированные патч может не всегда позволяют записи крупных и быстрых течений как напряжение закрытого Na⁺ токи (более подробные показания см ссылку ¹⁹). Кроме того R_s может варьироваться во время записи патч зажим, снова ведет к изменениям в текущей записи. Таким образом ложных срабатываний может возникнуть в ситуациях, когда R_s изменения во время применения препарата.

Электрофизиологии на кусочки ткани был впервые представлен Андерсен лаборатории по изучению электрофизиологических характеристик нейронов в мозге ²⁰. Техника проложили путь для подробного исследования одной клетки, а также связи и ячейки схемы ячеек в среде более нетронутыми. Подобный метод для изготовления гипофиза ломтики был представлен в 1998 году Guérineau et al. ²¹. Однако, он не был до 2005 года, что подготовка мозга гипофизарной срез был успешно используется для исследования патч зажим в костистых ²². В этом исследовании авторы также сообщили об использовании перфорированных патч зажим записей. Однако на сегодняшний день, большинство электрофизиологических исследований гипофиза клетки были проведены в млекопитающих и только горстка других позвоночных, включая костистых рыб ^1,2,22,23 . В teleosts почти все исследования были проведены на первичной диссоциированных клетки ^{24,25,26,27,28,29,30} .

В настоящем документе мы наметим оптимизированный протокол для приготовления здорового мозга гипофизарной фрагментов из рыбы оризии модели. Этот подход представляет собой ряд преимуществ, по сравнению с первичной диссоциированных клеточных культур. Во-первых клетки, записываются в среде относительно сохранились, по сравнению с отделить условий культуры клеток. Во-вторых ломтик препараты позволяют нам учиться косвенных путей, посредничестве ячеек связи ²², что невозможно в условиях культуре диссоциированных клеток. Кроме того мы показали, как проводить электрофизиологических записей на ломтики полученные тканей, с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим с амфотерицин в качестве агента порами формирования.

Оризии является небольшой пресноводных рыб, родом из Азии, главным образом найдены в Японии. Физиологии, эмбриологии и генетики оризии были широко изучены для более чем 100 лет ³¹, и это часто используемые исследовательской модели во многих лабораториях. Особое значение для этого документа является организация различных морфологических гипоталамус гипофиз комплекса в костистых рыб: в то время как в млекопитающих и птиц нейронов гипоталамуса освободить их нейро гормоны, регулирующие гипофиза эндокринные клетки в систему портала средний возвышение существует прямой нервной проекции нейронов гипоталамуса на эндокринные клетки гипофиза в ³²костистых рыб. Таким образом тщательно проведенных нарезки гипофиза мозга имеет особое значение в рыбе, что позволяет нам исследовать электрофизиологических характеристик гипофиза клетки в хорошо сохранившейся сети гипофиза мозга и в частности как гипофиза клетки контролировать их возбудимости и тем самым Ca^{2 +} гомеостаза.