תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף⁺ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

פתוגנים תאיים רבים מסתמכים על מכונות התא המארח כדי לשכפל, לעתים קרובות שינוי ביולוגיה של התא המארח או פילוח subpopulations מאוד ספציפי של התאים המארחים כדי להגדיל את סיכוייהם של התפשטות. כתוצאה מכך, תהליכים ביולוגיים תא הם בדרך כלל משובשות, עם השלכות מזיקות על הבריאות הכללית של המחשב המארח. הבנת את האינטראקציות בין וירוסים התאים מארח שבו הם לשכפל לאיפיון מנגנוני המחלה עשוי לסייע בפיתוח של טיפולים משופרים ואסטרטגיות כדי למנוע זיהום. כלים אנליטיים ישירה המאפשרים חקר אינטראקציות פתוגן-פונדקאי חיוניים לצורך כך. ניתוח מתא בודד מספק את האמצעי היחיד לייחס הסלולר פנוטיפ חד משמעית גנוטיפ מסוים או זיהום בסטאטוס¹. לדוגמה, זיהומים פתוגניים לגרום לעתים קרובות הן ישירים והן עקיפים שינויים בתוך התאים המארחים. לכן, הבחנה תאים נגועים מהקבצים המקבילים נגוע הכרחי לשינויים התא המארח התכונה זיהום ישירה או השפעות משניות, כגון מוכללת דלקת. יתר על כן, עבור גורמי מחלה רבים, כמו SIV ווירוסים הכשל החיסוני האנושי (HIV), זיהום התא המארח ממשיך דרך שלבים מרובים, כגון מוקדם, מאוחר, או סמויה, שכל אחד מהם עשוי להיות מאופיין על ידי גנים נפרדים פרופילי ביטוי חלבון^{2 , 3 , 4 , 5}. ניתוח בצובר של תערובות תא ייכשל ללכוד זה הטרוגניות⁶. לעומת זאת, מאוד מרובב תא בודד ניתוחים היכולת לכמת את הביטוי של שניהם ויראלי, מארח את הגנים מציעים אמצעים כדי לפתור לפליטת הסלולר זיהום ספציפיים, כולל וריאציות על פני שלבים זיהום. עוד, ניתוח האינטראקציות פתוגן-פונדקאי פיזיולוגית הגדרות רלבנטיות הינה קריטית לצורך זיהוי אירועים המתרחשים אורגניזמים נגועים. לכן, שיטות שניתן להחיל ישירות שמחוץ הם סביר להניח הטובה ביותר ללכוד ויוו תהליכים.

SIV ו- HIV היעד CD4⁺ T תאים, שבו הם לנטרל גורמים אנטי-ויראלי “הגבלה” המארח ו downregulate אנטיגן הצגת מולקולות ליצור זיהום פרודוקטיבי ולהימנע מעקב המערכת החיסונית^{7,8, 9,10,11}. ללא טיפול, הזיהום גורמת לאובדן מסיבי CD4⁺ T תאים, בסופו של דבר לשיאה רכשה כשל חיסוני תסמונת (איידס)¹². בהגדרה של טיפול תרופתי, התא הנגוע לחשוף מאגרים להימשך עשרות שנים, מתחזה מחסום אימתני אסטרטגיות המרפא. הבנה של מאפייני ויוו תאים HIV/סיב-הנגועים יש פוטנציאל לחשיפת תכונות התא המארח אינסטרומנטלי פתוגנזה והתמדה. עם זאת, זה מאוד מאתגרת, בעיקר בשל את low frequency של תאים נגועים וחוסר ריאגנטים בקלות להזדהות איתם. תאים לתמלל RNA נגיפי, מוערך להיות נוכח-0.01 – 1% של CD4⁺ T תאי דם, רקמת הלימפה^13,14,15. תחת טיפול מדכא, תאים נגועים לחשוף שכיחים פחות בגיל 10^-3–10^{-7 16,17,18}. חלבון נגיפי מכתים assays כי פועלות היטב עבור הלומדים חוץ גופית בתוך זיהומים, כגון איסור פרסום תאיים, הם שיוצרת בשל הרקע מכתים של 0.01 – 0.1%, דומה או גבוה יותר התדירות של תאים נגועים^{13, 14}. צביעת משטח החלבונים Env באמצעות נוגדנים חד-שבטיים סיב/HIV Env ספציפיים מאופיין היטב גם הוכח להיות קשה, ככל הנראה מסיבות דומות. לאחרונה, כלים חדשניים שואפים לשפר את הגילוי של תאים המבטאים את הבדיחה על-ידי שילוב מבחני ספציפי עבור החלטורה RNA או על-ידי שימוש חלופי הדמיה טכנולוגיות^14,15,19. עם זאת, גישות כאלה נשארים מוגבל במספר מדידות כמותיים מתבצע על כל תא.

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה (1) המזהה תאים הנגועים בנגיף בודדים ישירות שמחוץ מאת ג’ין ויראלי רגיש וספציפי כמותית qPCR ו- (2) מכמת את הביטוי של חלבונים פני שטח עד 18, גנים 96 לכל נגוע ( תא נגוע). מתודולוגיה זו משלב חלבון משטח תא בודד מדידה על ידי FACS ואחריו פירוק התא מיידית, ביטוי גנים באמצעות ניתוח מרובב יישוב qPCR במערכת Biomark. הטכנולוגיה מעגל משולב fluidic (IFC) מאפשר כימות מרובבת של גנים 96 מדגימות 96 בו זמנית, על ידי מטריצה של צ’יימברס 9,216 שבו מתבצעות תגובות qPCR בודדים. המיון תא חי FACS רשומות מדידות שפע חלבון גבוהה-תוכן תוך שמירה על transcriptome כולה לניתוח מתבצעת באופן מיידי במורד הזרם. כדי לזהות תאים הנגועים בנגיף, מבחני ספציפי עבור RNAs ויראלי, לחלופין משולבים, unspliced (vRNA) הינם כלולים בניתוח qPCR, יחד עם פאנל של מבחני על-ידי המשתמש, בהיקף של עד 96 גנים, המספר המרבי של מבחני השוהים כיום על IFC. ביטוי גנים ומידע חלבון שנאספו עבור כל תא מקושרות על-ידי מיקום טוב. אנחנו קודם לכן דיווח תוצאות של ניתוח זה במקום²⁰. כאן, אנו מספקים יותר מפורטות הנחיות מתודולוגי, כמו גם עוד יותר תיאורי phenotyping של CD4 הנגועים סיב⁺ T תאים.

גישה זו, אשר אנו המונח tSCEPTRE, ניתן ליישם את המתלים של כל האוכלוסייה קיימא תא תגובתי נוגדנים fluorescently שכותרתו, ביטוי של transcriptome תואם עם מבחני qPCR זמין. לדוגמה, זה יכול לשמש עבור אפיון גנים דיפרנציאלית וביטוי חלבונים תאים נדיר או תאים לא ברצון מכובד על ידי הדם שלה. הכנת הדוגמא מסתמכת על תקן מכתים פרוטוקול באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית. Cytometers עם יכולת מיון תא בודד הינם גם זמינים מסחרית, אך אמצעי אבטחה נוספים נדרשים לעיבוד זיהומיות תאים חיים. מקליט את פרופיל ביטוי יחיד – התא חלבון עבור כל תא על-ידי מיקום טוב, התייחס בזאת כפי באינדקס מיון, היא תכונה נפוצה FACS זמינים מסחרית מיון תוכנה. ניתוח חישובית של המארח באופן שונה ביטוי גנים בין אוכלוסיות תאים עניין לא מתואר כאן, אבל הפניות מסופקים לשיטות שפורסמו בעבר.