Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4⁺ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Viele intrazelluläre Erreger abhängig von Host Cell Maschinen zu replizieren, oft Host Zellbiologie zu verändern oder gezielt ganz bestimmte Subpopulationen von Wirtszellen zu maximieren Sie ihre Chancen auf Fortpflanzung. Infolgedessen sind biologischer Zellprozesse häufig gestört, mit schädlichen Folgen für die allgemeine Gesundheit des Wirts. Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Viren und den Wirtszellen, in denen sie replizieren, wird Krankheitsmechanismen aufzuklären, die in die Entwicklung von verbesserten Therapien und Strategien helfen kann, um Infektionen zu vermeiden. Direkte Analyse Tools, mit denen das Studium der Wirt-Pathogen Interaktionen sind zu diesem Zweck unerlässlich. Einzellige Analyse bietet die einzige Möglichkeit, eindeutig einen zellulären Phänotyp einer bestimmten Genotyp oder einer Infektion Wartestatus¹zuzuschreiben. Beispielsweise bedeuten pathogene Infektionen häufig sowohl direkte als auch indirekte Änderungen in Wirtszellen. Daher unterscheiden infizierte Zellen von nicht infizierten Gegenstücke ist notwendig, um Host Zelle Attributänderungen entweder direkte Infektion oder Nebenwirkungen, wie z. B. generalisierte Entzündung. Darüber hinaus für viele Krankheitserreger wie SIV und Human-Immundefizienz-Viren (HIV), Host Zelle Infektion durchläuft mehrere Phasen, wie früh, spät oder latent, von denen jedes kann durch verschiedene Gene und Protein-Expression profile² gekennzeichnet werden ^{, 3 , 4 , 5}. Bulk Analysen der Zelle Mischungen fehl, diese Heterogenität⁶zu erfassen. Dagegen sehr gemultiplext einzellige Analysen den Ausdruck beider Viren quantifizieren und Host Gene bieten ein Mittel zur Infektion-spezifische zelluläre Störungen, einschließlich Variationen über Stadien der Infektion zu beheben. Darüber hinaus analysieren Wirt-Pathogen Interaktionen in physiologisch relevante Einstellungen ist entscheidend für die Identifizierung der Ereignisse, die in infizierten Organismen auftreten. Also Methoden, die angewendet werden können, direkt ex Vivo sind wahrscheinlich beste Aufnahme in Vivo verarbeitet.

SIV und HIV Ziel CD4⁺ T-Zellen, in denen sie Host antivirale “Einschränkung” Faktoren und Downregulate antigenpräsentierende Moleküle, um produktive Infektion zu etablieren und zu vermeiden immunüberwachung^{7,8, entgegenwirken, 9,10,11}. Ohne Behandlung führt die Infektion zu massiven Verlust von CD4⁺ T Zellen letztlich gipfelte in erworbene Immunschwäche-Syndrom (AIDS)¹². In der Einstellung der antiretroviralen Therapie bestehen bleiben latent infizierten Zelle Stauseen jahrzehntelang posiert eine beeindruckende Sperre zu kurativen Strategien. Verständnis der Eigenschaften von in Vivo HIV/SIV-infizierten Zellen hat das Potenzial, Host Zelle Funktionen in der Pathogenese und Beharrlichkeit zu offenbaren. Allerdings ist dies sehr, vor allem aufgrund der Low frequency der infizierten Zellen und Reagenzien in der Lage, sie leicht zu identifizieren eine Herausforderung gewesen. Zellen, die virale RNA transkribiert werden voraussichtlich bei 0,01-1 % der CD4-Zellen im Blut und Lymphgewebe^13,14,15+ T. Unter suppressive Therapie sind latent infizierte Zellen sogar seltener um 10^-3– 10^{-7 16,17,18}. Virale Protein Beflecken assays, dass Arbeit auch für ein Studium in Vitro Infektionen, wie z. B. intrazellulären Gag sind suboptimale aufgrund Hintergrundfärbung von 0,01-0,1 %, ähnlich wie oder größer als die Häufigkeit der infizierten Zellen^{13, 14}. Oberfläche Beflecken für Env Protein mit gut charakterisierten SIV von HIV/AIDS Env-spezifischen monoklonalen Antikörpern ist auch nachgewiesen worden, wahrscheinlich aus ähnlichen Gründen schwierig sein. Vor kurzem, neuartige Werkzeuge wollen die Erkennung von Zellen Gag zu äußern, indem entweder verbessern Integration Tests speziell für Gag RNA oder durch die Verwendung alternativer bildgebender Technologien^14,15,19. Solche Ansätze bleiben jedoch beschränkt auf jede Zelle die Anzahl der quantitativen Messungen durchgeführt.

Wir beschreiben hier, Methodik, die (1) einzige Virus-infizierten Zellen identifiziert direkt ex Vivo von empfindlichen und spezifischen viralen Gens quantitative qPCR und (2) den Ausdruck von bis zu 18 Oberflächenproteine und 96 Gene für jeden infizierten quantifiziert (und nicht infizierte) Zelle. Diese Methode kombiniert einzelne Zelle Oberfläche Protein Messung durch FACS gefolgt von unmittelbaren Zelle Lysis und Gen-Ausdruck Analyse mit gezielten qPCR auf dem Biomark System gemultiplext. Die integrierte fluidische Schaltung (IFC) Technologie ermöglicht Multiplex Quantifizierung 96 Gene von 96 Proben gleichzeitig erreicht, indem eine Matrix von 9.216 Kammern, in denen die einzelnen qPCR Reaktionen durchgeführt werden. Die live FACS Zellsortierung zeichnet High-Content Protein Fülle Messungen während Erhaltung der gesamten transkriptoms für Analyse sofort durchgeführt stromabwärts. Um Virus-infizierten Zellen zu identifizieren, sind Tests speziell für Alternativ gespleißt und unspliced viralen RNAs (vRNA) enthalten in der qPCR-Analyse, zusammen mit einer Gruppe von benutzerdefinierten Assays in Höhe von bis zu 96 Gene, die Höchstzahl Assays, die derzeit untergebracht die IFC. Die Genexpression und Protein erfassten Daten für die einzelnen Zellen sind durch gut Position verbunden. Wir berichteten bereits Ergebnisse aus dieser Analyse an anderer Stelle²⁰. Hier bieten wir detaillierte methodische Richtlinien sowie weitere beschreibende Phänotypisierung von SIV-infizierten CD4⁺ T Zellen.

Dieser Ansatz, den wir tSCEPTRE nennen, kann an den Aufhängungen lebensfähigen Zellpopulation reaktiv, eindringmittel beschriftete Antikörper und mit dem Ausdruck einer Transkriptom kompatibel zur Verfügung qPCR Tests angewendet werden. Beispielsweise kann es für die Charakterisierung von differenziellen gen- und Proteinexpression in seltenen Zellen oder Zellen, die nicht leicht zu unterscheiden durch Oberfläche Protein-Marker verwendet werden. Die Probenvorbereitung stützt sich auf einen Standard Färbeprotokoll mit handelsüblichen Antikörpern. Cytometers mit einzelligen Sortier-Funktion sind auch im Handel erhältlich, aber zusätzliche biologische Sicherheit Vorsichtsmaßnahmen sind erforderlich für die Bearbeitung von infektiöser lebenden Zellen. Aufnahme der Single – Cell Protein Expressionsprofil für jede Zelle durch gut Lage, hierin ist als indiziert, Sortierung, ein gemeinsames Merkmal der im Handel erhältlichen FACS sortieren Software. Computergestützte Analyse von Host differentiell exprimierten Gene zwischen Zell-Populationen von Interesse ist hier nicht beschrieben, sondern Verweise werden bereitgestellt, um zuvor veröffentlichten Methoden.