Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto
Summary
Pez cebra son un natural Vibrio cholerae anfitrión y se puede utilizar para recapitular y estudiar el ciclo infeccioso de colonización a la transmisión. Aquí, demostramos cómo evaluar niveles de colonización de V. cholerae y cuantificar diarrea en pez cebra.
Abstract
Vibrio cholerae es mejor conocido como el agente infeccioso que causa el cólera enfermedad humana. Fuera del huésped humano, V. cholerae sobre todo existe en el medio acuático, donde interactúa con una variedad de especies acuáticas más altas. Vertebrados peces son conocidos por ser un anfitrión de medio ambiente y son un reservorio potencial de V. cholerae en la naturaleza. V. cholerae y las especies de peces teleósteos Danio rerio, conocidas comúnmente como el pez cebra, originan el subcontinente indio, lo que sugiere una interacción prolongada en ambientes acuáticos. Pez cebra son un organismo modelo para estudiar muchos aspectos de la biología, incluyendo enfermedades infecciosas. Pez cebra puede ser fácilmente y rápidamente colonizado por V. cholerae después de la exposición en agua. Colonización intestinal por V. cholerae conduce a la producción de la diarrea y la excreción de replicado V. cholerae. Estos excretan bacterias puede entonces ir a colonizar nuevos huéspedes de pescado. Aquí, demostramos cómo evaluar V. cholerae-colonización intestinal en pez cebra y cómo cuantificar V. cholerae-indujo diarrea de pez cebra. El modelo de colonización debe ser útil a los investigadores que están estudiando si los genes de interés pueden ser importantes para la colonización del huésped o supervivencia ambiental. La cuantificación de pez cebra diarrea debe ser útil a los investigadores estudiar cualquier patógeno intestinal que están interesados en explorar el pez cebra como modelo.
Introduction
Vibrio cholerae es una bacteria acuática, gram-negativa que provoca la cólera de la enfermedad humana como diarrea esporádica1,2. V. cholerae se encuentra en el medio ambiente en muchas áreas del globo, a menudo asociado con otros organismos acuáticos. Estos organismos asociando incluyen plancton, masas de huevos de insectos, crustáceos y vertebrados peces especies3,4,5,6,7. Varios estudios han aislado V. cholerae de los tractos intestinales de peces en diferentes áreas geográficas7,8,9,10. La presencia de V. cholerae en pescados indica que los peces pueden actuar como un reservorio ambiental. Peces también podrían estar implicados en la transmisión de la enfermedad a los seres humanos y en la difusión geográfica de V. cholerae las cepas6.
Para entender mejor cómo V. cholerae interactúa con pescado, Danio rerio, mejor conocido como pez cebra, fue desarrollado como un sistema modelo para el estudio de V. cólerae11. Pez cebra son nativas de Asia meridional, incluyendo la región de la bahía de Bengala, que se piensa para ser el primer reservorio de V. cholerae. Antes del primer comienzo pandemia de cólera en 1817, cólera no había divulgado fuera de lo que hoy es India y Bangladesh. Por lo tanto, pez cebra y V. cholerae seguramente asociados con otros sobre escalas de tiempo evolutivo, sugiriendo que pez cebra se encuentran a V. cholerae en el ambiente natural12.
El modelo de pez cebra para V. cholerae es simple de ejecutar y se puede utilizar para estudiar el patógeno entero ciclo de vida de V. cholerae . Peces están expuestos a V. cholerae por bañarse en el agua que ha sido inoculado con una cantidad conocida de V. cholerae. Dentro de unas horas, colonización intestinal tiene lugar, seguido por la producción de diarrea. Diarrea consiste en mucina, proteínas, bacterias excretadas y otros contenido intestinal. El grado de diarrea puede cuantificarse usando unos simples medidas13. V. cholerae que ha sido excretada por los peces infectados puede entonces pasar al infectar peces ingenuos, completando el ciclo infeccioso. Por lo tanto, el modelo de pez cebra recapitula el V. cholerae enfermedades humanas proceso12,14.
Lo más frecuentemente usado V. cholerae modelos animales han sido históricamente ratones y conejos14,15,16,17,18. Estos modelos han sido instrumentales en la adición a nuestro conocimiento de V. cholerae patogenia. Sin embargo, porque los ratones y los conejos no son natural V. cholerae hosts, hay limitaciones qué aspectos del ciclo de vida V. cholerae pueden ser estudiado. La colonización de V. cholerae de ratones y conejos por lo general requiere la ausencia de microbiota intestinal o un tratamiento previo con antibióticos para dañar la microbiota intestinal. Ambos modelos requieren sonda nasogástrica para introducir las bacterias del tracto digestivo o manipulación quirúrgica para inyectar directamente las bacterias en los intestinos. Pez cebra tienen una ventaja en que peces adultos con una microbiota intestinal intacta son fácilmente colonizados y el proceso infeccioso ocurre naturalmente, sin ninguna manipulación necesaria.
El presente trabajo muestra la utilización del pez cebra como modelo en la infección por V. cholerae . La infección, la disección, enumeración de colonización V. choleraey la cuantificación de la diarrea causada por V. cholerae será descrito12,13. Este modelo es probable ser útil para los científicos interesados en el proceso de la enfermedad de V. cholerae y el V. cholerae ambiental estilo de vida.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra es un modelo relativamente nuevo para el estudio de V. cholerae pero tiene mucho potencial para el descubrimiento futuro de aspectos desconocidos de V. cholerae biología y patogénesis11,12,13 . El modelo de pez cebra adulto tiene las ventajas de ser ambos naturales V. cholerae host que contiene microbiota intestinal intacta, maduro y un modelo ambiental. Desventajas del modelo son que lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a la melodía Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita y Donna Runft por sus esfuerzos en ayudar a desarrollar el modelo de pez cebra. La investigación divulgada aquí fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud, números de concesión R21AI095520 y R01AI127390 (a Jeffrey H. Withey). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
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