Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto
Summary
Zebrafish sono un naturale Vibrio cholerae host e può essere utilizzato per riassumere e studiare l’intero ciclo infettivo dalla colonizzazione alla trasmissione. Qui, dimostriamo come valutare i livelli di colonizzazione di V. cholerae e quantificare la diarrea in zebrafish.
Abstract
Vibrio cholerae è meglio conosciuto come l’agente infettivo che causa il colera malattia umana. All’esterno l’ospite umano, V. cholerae esiste principalmente per l’ambiente acquatico, dove interagisce con una varietà di specie acquatiche superiori. Pesci vertebrati sono noti per essere un host ambientale e sono un potenziale serbatoio di V. cholerae in natura. V. cholerae e le specie di pesci teleostei Danio rerio, comunemente note come zebrafish, hanno origine dal subcontinente indiano, suggerendo una lunga interazione in ambienti acquatici. Zebrafish sono un organismo modello ideale per studiare molti aspetti della biologia, tra cui le malattie infettive. Zebrafish può essere facilmente e rapidamente colonizzato da V. cholerae dopo l’esposizione in acqua. Colonizzazione intestinale da V. cholerae conduce alla produzione di diarrea e l’escrezione di replicata V. cholerae. Questi escreti batteri possono quindi andare a colonizzare nuovi host di pesce. Qui, dimostriamo come valutare V. cholerae-colonizzazione intestinale in zebrafish e come quantificare V. cholerae-indotto diarrea di zebrafish. Il modello di colonizzazione dovrebbe essere utile per i ricercatori che stanno studiando se geni di interesse possono essere importanti per la colonizzazione di host e/o per la sopravvivenza dell’ambiente. La quantificazione di zebrafish diarrea dovrebbe essere utile ai ricercatori di studiare qualsiasi agente patogeno intestinale che sono interessati ad esplorare zebrafish come sistema modello.
Introduction
Vibrio cholerae è un batterio gram-negativo, acquatico che causa il colera malattia umana così come diarrea sporadica1,2. V. cholerae è trovato nell’ambiente in molte aree del globo, spesso associato con altri organismi acquatici. Questi organismi associazione includono plancton, ovature di insetti, crostacei e pesci vertebrati specie3,4,5,6,7. Parecchi studi hanno isolato V. cholerae da tratti intestinali di pesce in diverse aree geografiche7,8,9,10. La presenza di V. cholerae in pesce indica che il pesce può agire come un serbatoio ambientale. Pesce potrebbe essere implicato anche nella trasmissione della malattia agli esseri umani e nella diffusione geografica di V. cholerae ceppi6.
Per comprendere meglio come V. cholerae interagisce con pesce, Danio rerio, meglio conosciuto come pesce zebra, è stato sviluppato come sistema modello per lo studio di V. colerae11. Zebrafish sono nativi di Asia del sud, compresa la regione del Golfo del Bengala, che è pensata per essere il primo serbatoio di V. cholerae. Prima del primo inizio pandemia colera nel 1817, il colera non era stato segnalato di fuori di quello che oggi è India e Bangladesh. Di conseguenza, zebrafish e V. cholerae quasi certamente associati con a vicenda su scale di tempo evolutivo, suggerendo che zebrafish sono un host V. cholerae nell’ ambiente naturale12.
Il modello di zebrafish per V. cholerae è semplice da eseguire e può essere usato per studiare l’intero patogeno V. cholerae ciclo di vita. Pesci sono esposti a V. cholerae di bagnarsi in acqua che è stato inoculato con un numero noto di V. cholerae. Entro poche ore, si svolge colonizzazione intestinale, seguita dalla produzione di diarrea. Diarrea è costituito da mucina, proteine, batteri escreti e altri contenuti intestinali. Il grado di diarrea può essere quantificato utilizzando pochi semplici misurazioni13. V. cholerae che è stata escreta dai pesci infettati può quindi andare per infettare pesce ingenuo, completando il ciclo infettivo. Di conseguenza, il modello di zebrafish ricapitola le V. cholerae malattia umana processo12,14.
Il più delle volte usato V. cholerae modelli animali sono stati storicamente topi e conigli14,15,16,17,18. Questi modelli sono stati strumentali in aggiunta alla nostra conoscenza della patogenesi di V. cholerae . Tuttavia, poiché topi e conigli non sono naturali V. cholerae padroni di casa, ci sono limitazioni a quali aspetti del ciclo di vita di V. cholerae possono essere studiati. La colonizzazione di V. cholerae di topi e conigli richiede in genere l’assenza di microbiota intestinale o un pretrattamento con gli antibiotici per danneggiare il microbiota intestinale. Entrambi i modelli richiedono o sonda gastrica per introdurre i batteri al tratto digestivo o manipolazione chirurgica per iniettare direttamente i batteri nell’intestino. Zebrafish hanno un vantaggio in quanto pesce adulto con un microbiota intestinale intatto sono prontamente colonizzati e il processo infettivo avviene naturalmente, senza alcuna manipolazione necessaria.
Il lavoro attuale dimostra l’utilizzo di zebrafish come un modello di infezione da V. cholerae . L’infezione, la dissezione, enumerazione di colonizzare V. choleraee la quantificazione di diarrea causata da V. cholerae sarà descritto12,13. Questo modello rischia di essere utile agli scienziati interessati sia nel processo di malattia V. cholerae e il lifestyle di V. cholerae ambientale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish è un relativamente nuovo modello per lo studio di V. cholerae ma molto promettente per la scoperta di futura aspetti inediti di V. cholerae biologia e patogenesi11,12,13 . Il modello di zebrafish adulto ha i vantaggi di essere sia un naturale V. cholerae host che contiene il microbiota intestinale intatto, maturo e un modello dell’ambiente. Svantaggi del modello sono che i due fattori di vir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie alla melodia Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita e Donna Runft per il loro impegno nel contribuire a sviluppare il modello di zebrafish. La ricerca segnalata qui è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numeri del premio R21AI095520 e R01AI127390 (per Jeffrey H. Withey). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
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