Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.
Doenças infecciosas transmitidas por vetores artrópodes continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana em todo o mundo. Os patogénios causadores dessas doenças, não existem isoladamente quando colonizam o vetor; em vez disso, eles provavelmente se envolvem em interações com microorganismos residentes no lúmen do intestino. A microbiota do vetor tenha demonstrada que desempenham um papel importante na transmissão de patógeno para várias doenças transmitidas por vetores. Se bactérias residentes no intestino do carrapato Ixodes scapularis , o vetor de diversos patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi, influenciam a transmissão de carrapato de patógenos não é determinado. Precisamos métodos para caracterizar a composição das bactérias associadas com o instinto de carrapato para facilitar uma melhor compreensão dos potenciais interações entre espécies no intestino carrapato. Usando toda a montagem em situ hibridização Visualizar transcritos de RNA associados a determinada espécie bacteriana permite a recolha de dados qualitativos sobre a abundância e a distribuição da microbiota no tecido intacto. Esta técnica pode ser usada para examinar as mudanças no meio de microbiota do intestino ao longo da escala de alimentação e também pode ser aplicada para analisar a expressão de genes de carrapato. Coloração de carrapato todo coragem rendimento informações sobre a distribuição espacial bruta do alvo do RNA no tecido sem a necessidade de reconstrução tridimensional e é menos afetada pela contaminação ambiental, que muitas vezes confunde o sequenciamento baseado métodos frequentemente utilizados para o estudo de comunidades microbianas complexas. Em geral, esta técnica é uma ferramenta valiosa que pode ser usado para melhor compreender a microbiota-vetor-patógeno interações e seu papel na transmissão da doença.
Humanos e gado patógenos transmitidos por artrópodes são encontrados em todo o mundo e representam cerca de 20% das doenças infecciosas globalmente1, mas eficaz e seguras vacinas contra a maioria desses patógenos não estão disponíveis. Nossa compreensão do importante papel dos microorganismos comensais, simbióticos e patogénicos, conhecidos coletivamente como o microbiome2, na modulação e moldar a saúde de quase todos os metazoários3 está se expandindo. Agora é evidente que os artrópodes vetores de patógenos também abrigam a microbiota do intestino e estes microbiota associada vetor foram mostrados para influenciar diversos patógenos vetor4,5. O artrópodes microbiome é composto de eubacteria, archaea, vírus e micróbios eucariontes como protozoários, nematoides e fungos6. No entanto, o foco de investigação predominante tem sido em eubacteria devido, em parte, à existência de genes marcadores e bancos de dados de referência para identificar membros bacterianos específicos.
Com foco em Ixodes scapularis, o vetor de escala de vários patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi7, o agente causador da doença de Lyme, a otimização de uma técnica de visualização microbiana visava melhorar a nossa compreensão da microbiota do intestino carrapato no contexto das interações de vetor-patógeno. Várias questões permanecem para ser respondida no campo microbiome carrapato. O intestino é o local do primeiro encontro estendido entre o carrapato e o patógeno recebido no contexto de patógenos transferidos horizontalmente; Portanto, compreender o papel da microbiota do intestino vector em modulação interações vetor-patógeno irá revelar ideias significativas. Carrapatos têm um modo exclusivo de digestão da refeição de sangue, onde o processamento de farinha de sangue componentes leva intracelular Coloque8. O lúmen do intestino, aparentemente, serve como um recipiente para conter a refeição de sangue como os feeds de carrapato e assimilação e digestão de nutrientes ensue ao longo de vários dias de alimentação e continuam repletion pós. Os patógenos adquiridos pelo carrapato durante a alimentação entram o lúmen do intestino junto com a farinha de sangue e o lúmen torna-se assim um local principal de interações entre o carrapato, patógeno e microbiota residente. Como digestão prossegue através do repletion e carrapato Ixodid muda, o intestino sofre alterações estruturais e funcionais9. A composição e a organização espacial das bactérias do intestino também é susceptível de variar em concerto com o meio de intestino a mudança. É, portanto, importante compreender a arquitetura de bactérias residentes no intestino carrapato para compreender inteiramente a interação de carrapato, patógeno e microbiota do intestino.
Técnicas moleculares para descrever a microbiota associado anfitrião rotineiramente utilizam estratégias de sequenciamento paralelo elevado-throughput10 para amplificar e sequência de ADN ribossómico de 16S bacteriano (rDNA). Estas estratégias de sequenciamento contornar a necessidade de obter axénica culturas de bactérias específicas e fornecer uma descrição detalhada de todos os membros bacterianas representada na amostra. No entanto, tais estratégias são confundidas pela incapacidade de distinguir as contaminações ambientais de residentes de bona fide . Além disso, quando avaliar amostras, tais como carrapatos, que são pequenos em tamanho e, portanto, contenham baixa microbiota específica DNA produz, a probabilidade de amplificação dos contaminantes ambientais é o aumento de11 e resulta na interpretação ambígua de Microbiome composição. Caracterização funcional em conjunto com a visualização de determinadas bactérias viáveis, portanto, será fundamental para definir e discernir a microbiome do tique-taque, temporalmente e espacialmente. Para atingir este objectivo, aproveitamos a toda a montagem do RNA em situ da hibridação. Esta técnica é usada rotineiramente para avaliar padrões de expressão de genes em embriões e órgãos12,13,14 e permite análise semiquantitativa de expressão ao longo de toda a amostra de interesse. Isso difere do tradicional em situ hibridização as técnicas que utilizam cortes de tecido e muitas vezes exigem extensa análise do material seccionado com uma montagem computacional para prever a expressão em todo os órgãos15. Enquanto toda a montagem geralmente se refere a toda organismos12, aqui toda a montagem refere-se a toda coragem ou órgãos. As vantagens de usar a conjunto de montagem do RNA em situ hibridização abordagem para avaliar a arquitetura da microbiota do intestino de carrapato são múltipla. O intestino do carrapato é composto de 7 pares de divertículos, cada par variando em tamanho16. As diferenças funcionais, se algum, entre esses divertículos, não são compreendidas no contexto da biologia de carrapato, assinale a microbiota ou carrapato-patógeno interações. Manipulações do intestino que rompem os divertículos de intestino deslocaria a microbiota presente no lúmen do intestino ou os associados frouxamente o intestino e resultar em erros de interpretação da localização espacial da microbiota. Fluorescência-etiquetada do RNA em situ hibridização tem sido utilizada anteriormente para examinar o carrapato intestino transcrições17 fixação e abrindo divertículos de intestino individuais para garantir a hibridização da sonda e localizar b. burgdorferi transcrições secionando parafina toda carrapatos18. Ambas essas abordagens exigem manipulações dos tecidos carrapato antes da hibridização que afetaria a arquitetura de microbiota do intestino.
Neste relatório, descrevemos em detalhe o protocolo para examinar a escala viável gut microbiota usando toda a montagem em situ da hibridação (WMISH). O uso de toda a montagem do RNA em situ da hibridação permite um entendimento global da presença e abundância de bactérias do intestino específicas nas diferentes regiões do intestino e pode estimular novos insights sobre biologia de intestino carrapato no contexto da colonização do patógeno e transmissão. Além disso, a utilização de sondas de RNA dirigida contra RNA bacteriano específico permite a detecção de bactérias viáveis no intestino carrapato.
Este é o primeiro uso de uma técnica de hibridização (WMISH) toda a montagem em situ para estudar a microbiota de um vetor de artrópodes de patógenos. Nosso protocolo foi adaptado de um usado para estudar o desenvolvimento em Drosophila e em embriões de rã25,26. Toda a montagem do RNA em situ hibridização tem sido usada rotineiramente para localizar transcritos do gene espacialmente e temporalmente27 e …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Yale University, para proporcionar a utilização dos seus recursos de laboratório. Agradecemos ao Sr. Wu Ming-Jie excelente assistência técnica. EF é um investigador HHMI. Este trabalho foi apoiado por um presente do John Monsky e Jennifer Weis Monsky fundo de pesquisa de doença de Lyme.
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
#11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
Light box | VWR | 102097-658 | |
PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |