التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين
Summary
نقدم هنا، بروتوكول مكانياً وزمنياً تقييم وجود الحجمية قابلة للتطبيق في الشجاعة التجزئة باستخدام نهج تعديل الجامعة-جبل تهجين في الموقع.
Abstract
تواصل الأمراض المعدية المنقولة بواسطة ناقلات المفصلية تشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. مسببات الأمراض تسبب هذه الأمراض، ولا توجد في عزلة عندما أنهم استعمار ناقلات الأمراض؛ بدلاً من ذلك، يرجح أن يخوضوا في التفاعل مع الكائنات الدقيقة المقيمة في تجويف القناة الهضمية. قد تجلى الحجمية متجه تلعب دوراً هاما في انتقال مسببات المرض للعديد من الأمراض التي تحملها ناقلات المرض. لم يتم تحديد ما إذا كانت البكتيريا المقيمة في الأمعاء الغليظة للقراد سكابولاريس إيكسوديس ، ناقل للعديد من مسببات الأمراض البشرية بما في ذلك البورليه burgdorferi، التأثير القراد انتقال مسببات الأمراض. نحن تتطلب أساليب لوصف تكوين البكتيريا المرتبطة بالقناة الهضمية التجزئة لتيسير فهم أفضل للتفاعلات فيما يحتمل في القناة الهضمية القراد. استخدام كل جبل في الموقع التهجين لتصور الجيش الملكي النيبالي النصوص المرتبطة بالأنواع البكتيرية خاصة تسمح لجمع البيانات النوعية فيما يتعلق بوفرة وتوزيع الحجمية في أنسجة سليمة. هذا الأسلوب يمكن استخدامه لدراسة التغيرات في الوسط الحجمية القناة الهضمية على مدى القراد التغذية ويمكن تطبيقها أيضا على تحليل الجينات القراد. تلوين كامل التجزئة الشجاعة العائد من المعلومات حول التوزيع المكاني الإجمالي لهدف الجيش الملكي النيبالي في الأنسجة دون الحاجة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد وهو أقل تأثرا بالتلوث البيئي، الذي كثيرا ما يفند القائم على التسلسل الطرق استخداماً في دراسة المجتمعات الميكروبية المعقدة. وعموما، هذا الأسلوب هو أداة قيمة يمكن استخدامها لتحسين فهم التفاعلات المتجهات-الممرض-الحجمية ودورها في نقل الأمراض.
Introduction
مسببات الأمراض البشرية والحيوانية المرسلة بواسطة ناقلات المفصلية يتم العثور عليها في جميع أنحاء العالم، وتستأثر بحوالي 20 في المائة أمراض المعدية على الصعيد العالمي1، ولكنها فعالة، ولا تتوفر لقاحات آمنة ضد معظم هذه العوامل المسببة للمرض. هو توسيع فهمنا للدور الهام للكائنات المجهرية commensal والتكافلية والمسببة للأمراض، المعروفة بميكروبيومي2، في تحوير وتشكيل صحة تقريبا جميع ميتازوانس3 . من الواضح الآن أن المفصليات الناقلة لمسببات الأمراض أيضا ميناء الحجمية القناة الهضمية وأظهرت هذه الحجمية المرتبطة بمكافحة ناقلات للتأثير على مختلف مسببات الأمراض المحمولة بالنواقل4،5. وتتألف من eubacteria والعتيقات، والفيروسات والميكروبات حقيقية النواة مثل البروتوزوا والديدان الخيطية والفطريات6ميكروبيومي المفصلية. بيد الأبحاث الغالبة انصب التركيز على eubacteria يرجع، جزئيا، إلى توافر علامة الجينات وقواعد بيانات مرجعية لتحديد أعضاء بكتيرية معينة.
مع تركيز على سكابولاريس إيكسوديس، ناقلات التجزئة من مسببات الأمراض البشرية متعددة بما في ذلك، البورليه burgdorferi7المسبّب لمرض لايم، الاستفادة المثلى من تقنية التصور الميكروبية تهدف إلى تحسين فهمنا للتجزئة الحجمية القناة الهضمية في سياق التفاعلات الممرض متجه. تظل عدة أسئلة يتعين الإجابة عليها في ميدان ميكروبيومي التجزئة. القناة الهضمية هو موقع أول لقاء موسع بين القراد والممرض واردة في سياق الكائنات الممرضة المنقولة أفقياً؛ ولذلك، فهم دور ناقل القناة الهضمية الحجمية في تحوير التفاعلات الممرض ناقلات سوف تكشف عن رؤى مفيدة. القراد بطريقة فريدة من نوعها لهضم وجبة الدم، حيث تجهيز وجبة الدم مكونات يأخذ مكان إينتراسيلولارلي8. تجويف القناة الهضمية على ما يبدو بمثابة وعاء لاحتواء وجبة الدم كما يغذي القراد، والهضم المغذيات والاستيعاب تترتب على ذلك طوال عدة أيام من التغذية ومواصلة الإحلال بعد. أدخل مسببات الأمراض المكتسبة بالقراد أثناء تغذية التجويف القناة الهضمية جنبا إلى جنب مع بلودميل وبالتالي يصبح التجويف موقع أساسي للتفاعلات بين القراد، والممرضات، والحجمية المقيم. كما عائدات الهضم عن طريق الإحلال والتجزئة إيكسوديد الصوف، يخضع القناة الهضمية9من التغييرات الهيكلية والوظيفية. التكوين وتنظيم المكانية بكتيريا القناة الهضمية من المرجح أن تختلف في الحفل مع الوسط القناة الهضمية المتغيرة أيضا. ولذلك، من المهم فهم بنية البكتيريا المقيمة في الأمعاء القراد تماما فهم التفاعل بين التجزئة والممرض والحجمية القناة الهضمية.
التقنيات الجزيئية لوصف الحجمية المرتبطة بالمضيف بشكل روتيني استخدام تسلسل المتوازي الفائق استراتيجيات10 إلى تضخيم وتسلسل الحمض النووي ريبوسومال 16S البكتيرية (المتاشب). هذه الاستراتيجيات تسلسل التحايل على الحاجة إلى الحصول على الثقافات أكسينيك من بكتيريا محددة، وتوفير وصف متعمق لجميع أعضاء البكتيرية الممثلة في العينة. ومع ذلك فهي خلطت بين هذه الاستراتيجيات بعدم القدرة على التمييز بين التلوث البيئي من المقيمين في حسن النية . علاوة على ذلك، عند تقييم العينات، مثل القراد، أن صغيرة في حجمها ومن ثم تحتوي على الحمض النووي الخاصة الحجمية منخفضة الغلة، احتمالات تضخيم ملوثات البيئية هو زيادة11 والنتائج في تفسير غامض تكوين ميكروبيومي. ولذلك توصيف وظيفي بالاقتران مع تصور البكتيريا قادرة على البقاء محددة سيكون حاسما لتحديد وتمييز ميكروبيومي القراد زمنياً ومكانيا. نحو تحقيق هذا الهدف، ونحن استغل من الحمض النووي الريبي التهجين الجامع-جبل في الموقع . هذه التقنية تستخدم بشكل روتيني لتقييم أنماط التعبير الجيني في الأجهزة والأجنة12،،من1314 ويسمح تحليل مسوحات للتعبير على نموذج كامل للفائدة. وهذا يختلف عن التقليدي في الموقع تقنيات التهجين التي تستخدم أقسام الأنسجة وغالباً ما تتطلب تحليل مستفيض للمواد مقطعة مع الجمعية حسابية للتنبؤ بالتعبير في كامل أجهزة15. بينما يشن كل يشير عموما إلى كل الكائنات الحية12، هنا كل-جبل يشير إلى الشجاعة كله أو الأجهزة. مزايا استخدام الحمض النووي الريبي الجامع-جبل في الموقع التهجين نهج لتقييم هيكل التجزئة الحجمية القناة الهضمية المتعددة الوجوه. تتألف القناة الهضمية التجزئة 7 أزواج من رتوج، كل زوج متفاوتة في حجم16. الاختلافات الوظيفية، إذا وجدت، بين هذه رتوج، غير مفهومة في سياق التجزئة البيولوجيا، ضع علامة أمام تفاعلات الحجمية أو الممرض القراد. سوف يزيح التلاعب من القناة الهضمية التي تمزق رتوج الأمعاء الحجمية موجودة في تجويف القناة الهضمية أو تلك المرتبطة فضفاضة بالقناة الهضمية والنتيجة في التفسير الخاطئ لتوطين الحجمية المكانية. وقد استخدمت الأسفار المسماة الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين في وقت سابق لدراسة القراد القناة الهضمية المستنسخات17 من خلال تحديد وفتح رتوج الأمعاء الفردية لضمان التحقيق التهجين وتعريب burgdorferi (ب) النصوص بتقطيع القراد كلها جزءا لا يتجزأ من البارافين18. تتطلب كلا من هذين النهجين التلاعب في الأنسجة التجزئة قبل التهجين التي تؤثر على بنية الحجمية القناة الهضمية.
في هذا التقرير، يصف لنا بالتفصيل على دراسة الحجمية القناة الهضمية القراد قابلة للتطبيق الجامع-جبل في الموقع التهجين (وميش) باستخدام البروتوكول. استخدام الحمض النووي الريبي الجامع-جبل في الموقع التهجين يمكن فهم عالمي لوجود ووفرة من بكتيريا القناة الهضمية محددة في مناطق مختلفة من القناة الهضمية وقد حفز رؤى جديدة في الأحياء القناة الهضمية القراد في سياق الاستعمار الممرض وانتقال العدوى. علاوة على ذلك، يتيح استخدام الحمض النووي الريبي المجسات الموجهة ضد الجيش الملكي النيبالي بكتيرية معينة الكشف عن البكتيريا قادرة على البقاء في القناة الهضمية القراد.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهذا هو أول استخدام لتقنية التهجين (وميش) كل جبل في الموقع لدراسة الحجمية لمتجه المفصلية من مسببات الأمراض. وكان لدينا بروتوكول مقتبس من واحد يستخدم لدراسة التنمية في المورفولوجية والضفدع الأجنة25،26. كل يشن الجيش الملكي النيبالي في الموقع الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور مصطفى الخوخة مع، جامعة ييل، مخلصا لتوفير استخدام الموارد المختبر له. ونحن ممتنون للسيد وو جي مينغ للمساعدة التقنية الممتازة. EF محقق HHMI. وأيد هذا العمل هدية من جون مونسكي وجينيفر ويس مونسكي صندوق أبحاث مرض لايم.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
