2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Preparação de transgénicos Arabidopsis cultura linhas celulares, incluindo condições de clonagem, transformação, seleção e crescimento pode ser encontrada em17. Observe que as linhas de controle EV são recomendadas para corrigir a falsos positivos. Antes do experimento, confirme a superexpressão da proteína isca por análise ocidental do borrão, por exemplo, usando anticorpos IgG contra a parte de G-proteína da marca afinidade em tandem. É importante separar os meios de crescimento do material de cultura de células vegetais. 1. preparar o Material de célula vegetal antes do experimento Cresce uma linha de cultura celular PSB-L a. thaliana superexpressão da proteína de interesse18. Prepare o meio de MSMO, que contém 4,43 g/L que MSMO misturado com sacarose 30 g/L. Ajuste o pH da reserva para 5,7 com 1m KOH e autoclave a solução. Antes do experimento, suplemento médio com 0,5 mg/L ácido α-naftalenoacético, Quinetina 0,05 mg/L e 50 canamicina μg/mL. Cultive culturas de células vegetais transformados em 50 mL de meio MSMO num balão de 100 mL em um agitador orbital plataforma com agitação suave (130 rpm). Desenvolvem-se células em uma sala de cultura a 20 ° C e luz de intensidade igual a 80 μmol m-2 s-1. Células de subcultura em mídia fresca a cada 7 dias, dilui-los 01:10. Colete as células em fase de crescimento logarítmico, usando um funil de vidro combinado com uma bomba de vácuo, usando uma malha de nylon como filtro. Embrulhe o infiltrado em folha de alumínio e congelamento em nitrogênio líquido.Atenção: Lembre-se que o nitrogênio líquido é extremamente frio. Manuseio incorreto pode causar queimaduras. Usar equipamento de protecção adequado, incluindo termicamente isolado, luvas, óculos de proteção e um jaleco. 2. toque em protocolo Nota: O passo seguinte é adaptado do Maeda et al 201411 e Van Viviane Lopes et al 201117. Homogeneizar o material de cultura de células de plantas colhidas e congeladas usando um moinho misturador (2 min a 20 Hz) ou pilão para obter o pó fino. Alíquota 3 g do material solo (correspondente a cerca de 90 mg de proteína total) por amostra. Evite descongelar da amostra durante esta etapa, usando equipamento pre-refrigerados de nitrogênio líquido.Nota: Loja terreno material vegetal em tubo de 50ml a 80 ° C ao início de um processo de AP. Triture a amostra num almofariz líquido-nitrogênio-pré-resfriado com 3 mL de tampão de Lise gelada (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl 1,5 mM MgCl20,5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM at3VO4; 100 x coquetel de inibidor de protease comercial diluído; 1 mM PMSF) até o material derrete. Uma vez que a amostra está pronto, proceda imediatamente para a próxima etapa.Nota: Prepare o fresco de tampão de Lise. Introduza amostras em branco neste passo. Detergentes não são recomendados, pois eles podem causar problemas na deteção de MS. Para remover restos celulares, divida o material em 2 mL microcentrifuge tubos e centrifugar 20.817 x g por 10 min a 4 ° C. Colete 3 mL do lisado claro em um tubo de centrifuga conico de 15 mL. Durante a etapa de centrifugação, equilibrar IgG-Sepharose grânulos. Alíquota 100 µ l de grânulos por amostra e lavá-los com 1 mL de tampão de Lise. Vórtice para Ressuspender grânulos e flash-spin. Descartar a Lise e repita a etapa duas vezes. Resuspenda grânulos em 400 µ l de tampão de Lise. Adicionar contas a planta coletada lisada e incubar a mistura em uma roda rotativa para 1 h a 4 ° C. Transferência a mistura em uma seringa combinados através de tampa Luer-lock com uma coluna de rotação com filtro poro tamanho 35 µm. Aplique pressão para passar o lisado através de. Grânulos com complexos anexados permanecerá no filtro, enquanto o lisado atravessará.Nota: Opcionalmente, use um sistema de colector de vácuo. Certifique-se de aplicar uma pressão suave para não prejudicar os grânulos. Lave os grânulos no começo com 10 mL de tampão de lavagem (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl) e em seguida com 1 mL de tampão de eluição (0,5 mM EDTA, pH 10 mM Tris-HCl 7,5; 150 mM NaCl; 1000 x diluídos E64 e 1 mM PMSF). Realize a lavagem usando uma seringa anexada à coluna ou sistema colector de aspiração.Nota: Quando usando um sistema de colector de vácuo certifique-se de aplicar uma pressão suave para não prejudicar os grânulos. Incubar a contas com a 400 µ l de tampão de eluição contendo 50 U de uma versão melhorada do tabaco etch protease do vírus (AcTEV). Usar agitador de mesa a 1.000 rpm por 30 min a 16 ° C.Nota: Lembre-se de usar um plug para fechar a coluna na parte inferior, adicionando o tampão de eluição. Adicione uma porção extra (50 U) da enzima na coluna e incubar a mistura durante o próximo 30 min sob o mesmo, descritas acima, as condições. Recolha o eluato em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL por centrifugação (1 min, 20.817 x g) ou pelo distribuidor de vácuo. Para remover o restantes complexos, introduza uma etapa de eluição adicionais usando 200 µ l de tampão de eluição.Nota: Guarde a amostra a – 20 ° C ou 80 ° C, ou imediatamente prosseguir com a etapa de extração da proteína e do metabólito. Descongele as amostras congeladas no gelo. 3. análise ocidental do borrão Para confirmar a presença da isca proteína no eluato coletado usar 10 µ l do eluato proteicos – metabólito para executar SDS-PAGE e análise ocidental do borrão. Para identificar a proteína de interesse, use os anticorpos primários do mouse contra streptavidin-proteína (1: 200), uma parte da marca TAP remanescentes após a clivagem de protease TEV, conforme descrito em Van Viviane Lopes et al . 201117. Em seguida, use anticorpos de cabra secundário anti-rato juntamente com HRP. 4. o metabólito e extração da proteína Nota: Este protocolo é adaptado de Giavalisco et al . 201116. Nota: Desta etapa em diante use soluções de UPLC-MS – grau. Adicionar 1 mL de metil tert-butil éter (MTBE) / metanol/água solvente (3:1:1) para o eluído coletado e misturar a amostra por inversão. Certifique-se que o solvente é resfriado a – 20 ° C, antes da etapa de extração.Cuidado: MTBE e metanol são substâncias nocivas. Executar a etapa de extração sob a coifa e use equipamento de proteção pessoal apropriado, por exemplo, luvas. Adicionar 0,4 mL de metanol: água, solução de 1:3 para cada amostra e misture o conteúdo da amostra por inversão.Nota: A suplementação da mistura com uma solução de metanol: água resulta em separação de fases. A fase superior contém lipídios, fase inferior contém semi unipolares e de metabólitos e proteínas podem ser encontradas na pelota. Para separar as fases, centrifugar a amostra a 20.817 x g por 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, coletar a fase superior para medições de lipídios (não é feito no presente protocolo) utilizando uma pipeta de movimentação manual de líquidos com capacidade de volume de 1 mL. Adicione 0,2 mL de metanol e misturar por inversão. Centrifugar a amostra a 20.817 x g por 2 min em RT e, em seguida, coletar a fase polar para medições de metabólito (compostos polares e semi polares). Para evitar perturbar a pelota de proteína, embora cerca de 50 µ l da fase líquida na parte inferior do tubo. Amostras coletadas secas para medições de metabólito durante a noite em um evaporador centrífugo. Evite ressecamento as pelotas de proteína removendo amostras do evaporador após 30-60 min.Nota: Guarde as amostras a – 20 ° C ou 80 ° C, ou proceder imediatamente com a preparação de proteínas para análise de LC-MS/MS. 5. preparação de amostras para análise de Proteomic Nota: Este passo é uma adaptação de Olsen et al . 200419 e o manual técnico da tripsina/Lys-C Mix (ver Tabela de materiais). Realize a digestão enzimática da amostra.Cuidado: Solventes utilizados durante a digestão enzimática e dessalinização da amostra são prejudiciais. Trabalhar sob a coifa e use equipamento de proteção pessoal apropriado, por exemplo, luvas. Dissolva a pelota de proteína em 30 µ l de tampão de desnaturação recentemente preparada (40mm bicarbonato de amónio contendo ureia de tioureia/6 M 2 M, pH 8). Para conseguir melhor solubilidade da proteína, execute uma etapa sonication 15min. Repita o passo até que se dissolva a pelota. Centrifugar a amostra a 20.817 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Determine a concentração de proteína usando o ensaio da proteína de Bradford. Para mais análise, alíquota um volume equivalente a 100 µ g de proteína e enchem a amostra até 46 µ l de buffer de desnaturação. Adicionar ao µ l amostra 2 de buffer de redução recentemente preparada (50 mM DTT dissolvido em H2O) e incube por 30 min à temperatura ambiente. Tratar a amostra com 2 µ l de tampão de alquilação recentemente preparada (150 mM iodoacetamide dissolvido em 40 mM de tampão de bicarbonato de amónio) e incubar a mistura no escuro por 20 min em temperatura ambiente. Diluir a amostra com 30 µ l de tampão de bicarbonato de amónio de 40 mM e adicionar 20 µ l do Mix de LysC/tripsina. Após a incubação de 4 h a 37 ° C, dilua a amostra com 300 µ l de tampão de bicarbonato de amónio de 40 mM. Continuar com pernoite incubação a 37 ° C. Acidificar a amostra com cerca de 20 µ l de ácido trifluoroacético (TFA) para obter pH < 2 a 10%. Verifica o pH de amostra usando uma faixa de pH.Nota: Guarde a amostra a – 20 ° C ou prosseguir para a próxima etapa. Do desalt as proteínas digeridas.Nota: De preferência, use um sistema de colector de vácuo. Evite a secagem excessiva da coluna. Lavar a coluna SPE C18 (ver Tabela de materiais) com 1 mL de 100% MeOH e em seguida com 1 mL de 80% acetonitrila (ACN) contendo 0,1% TFA diluído em água. Passos de utilização, aqui e em mais proteína-dessalinização, um sistema distribuidor de vácuo para acelerar o processo. Evite a secagem excessiva da coluna. Equilibrar a coluna lavando-a duas vezes com 1 mL de 0.1% TFA diluído em água. Carrega a amostra para a coluna. Tubo de enxaguadura com adicional 200 µ l de 0,1% TFA e transferir a solução na coluna. Execute as soluções através da coluna. Lavar a coluna duas vezes com 1 mL de 0.1% TFA. Eluir demolhados peptídeos da coluna com 800 µ l de 60% ACN, solução de 0,1% TFA. Seque a fração coletada em um evaporador centrífugo, evitando o ressecamento da fração proteína removendo amostras do evaporador após 30-60 min.Nota: Guarde as amostras a – 20 ° C ou 80 ° C ou imediatamente prosseguir para a próxima etapa. Em etapas subsequentes, manter as amostras no gelo. 6. medição preparou amostras de proteínas usando UPLC-MS/MS. Nota: Antes de medições proteómica e metabolómica, filtrar (tamanho de poro de 0,2 µm) e desgaseificar todos os buffers usando uma bomba de vácuo por 1h. Pellet de peptídeo Ressuspender secada armazenado em tubo de microcentrifuga 2 mL em 50 µ l de tampão C (3% v/v ACN, 0,1% v/v de ácido fórmico) usando pipeta de movimentação manual de líquidos com capacidade de volume 200 µ l. Proceda à sonicação amostras para um 15 min em um banho ultra-sônico com frequência ultra-sônica de 35 kHz.Cuidado: ACN e ácido fórmico são substâncias nocivas. Trabalhar sob a coifa e use equipamento de proteção pessoal apropriado, por exemplo, luvas. Centrifugar a amostra a 20.817 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, transferir 20 µ l do sobrenadante para um frasco de vidro. Peptídeos digeridos separados, usando uma coluna de fase reversa C18 conectem a uma cromatografia líquida e adquirem espectros de massa usando um espectrômetro de massa. Separe na coluna 3 µ l da amostra usando uma taxa de fluxo de 300-nl/min. Para uma fase móvel, use buffer C e D (63% v/v do Grupo ACN, ácido fórmico a 0,1% v/v), formando um gradiente de subida de 3% ACN para 15% ACN mais 20 min e depois para 30% ACN durante o próximos 10 min.Nota: Guarde o resto da amostra a – 20 ° C ou 80 ° C até alguns meses. Antes da medição de proteomic, congelar a amostra em gelo. Desbotar contaminantes por 10 min, utilizando 60% ACN e equilibrar a coluna com 5 µ l de tampão C antes da medição da próxima amostra. Obter espectros de massa usando método de MS/MS dependente de dados com o conjunto de resolução de 70.000, alvo AGC de 3e6 íons, tempo de injeção máxima de 100 ms e um m/z variando de 300 a 1600. Adquira o máximo de varreduras de 15 MS/MS em uma resolução de 17.500, alvo AGC de 1e5, tempo de injeção máxima de 100 ms, relação de underfill de 20%, com uma janela de isolamento de 1,6 m/z e m/z, que variam de 200 a 2000. Ative o gatilho de ápice (6 – 20 s), a exclusão dinâmica definidos para 15 s e excluir acusações de 1 e 5 >. 7. tratamento de dados Proteomic Baixar o banco de dados mais recente do proteome de Arabidopsis thaliana de http://www.uniprot.org/ e incluir o banco de dados do contaminante. Analisar dados brutos obtidos a partir de LC-MS é executado usando a MaxQuant com o motor integrado de busca do peptide Andromeda usando a configuração padrão com habilitado LFQ normalização20,21,22. Encontre informações detalhadas sobre parâmetros usados na Tabela S1. Abra o arquivo de saída “groups.txt de proteína”. Para posterior análise, filtro para proteína grupos identificados pelo menos dois peptídeos exclusivos. Remova grupos de proteína definidos por MaxQuant como potenciais contaminantes e filtro para a. thaliana proteínas (ARATH na coluna de cabeçalhos de Fasta) presentes no banco de dados. Para testar a significância de enriquecimento de proteína entre as amostras, usar intensidades LFQ normalizado e executar o teste t de Student não pareado, bicaudal seguido por correção de comparação múltipla(por ex. Benjamini & Hochberg falsa descoberta alíquota (FDR) correção ou correção de Bonferroni). Calcule o p-valor, comparando as intensidades LFQ obtidas para controle de EV e NDPK1. Filtre todos os valores indeterminados. Classificar em ordem crescente de p-valores e usar o script de R ou calculadora on-line (por exemplo, https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) para calcular a correção do FDR. Filtro para valores FDR abaixo de 0,1.Nota: Considere a forma de análise de dados apropriados para a pesquisa. Para estudos quantitativos (análise de enriquecimento de proteína entre amostras) usam o valor de “Intensidade LFQ”, Considerando que para a pesquisa qualitativa (presença ou ausência de proteína em particular), escolha o valor da “Intensidade”. Filtro para grupos de proteínas que são mais abundantes em NDPK1 comparando com controle de EV. Determinar a localização de potenciais parceiros de proteína usando o banco de dados SUBA23 e correto para proteína co localizados com NDPK1. 8. medição de amostras contendo fase Polar usando UPLC-MS. Resuspenda seca fase polar de passo 4.5 em 200 µ l de água e proceda à sonicação a amostra por 5 min. Centrifugar a amostra a 20.817 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um frasco de vidro.Nota: Guarde o resto da amostra a – 20 ° C ou 80 ° C por até diversos meses. Antes da medição da metabolómica, congelar a amostra em gelo. Executar uma etapa de separação usando UPLC acoplado à coluna de fase reversa C18 e adquirir os espectros de massa com MS. Carregar para o µ l coluna 2 da amostra por injecção para cada modo de ionização (positivo e negativo) e separar a fração usando 400 µ l/min de vazão. Para criar o gradiente necessário para medição do metabólito, preparar a solução de fase móvel da seguinte forma: um (ácido fórmico 0,1% em H2O) do buffer e buffer B (0,1% ácido fórmico no Grupo ACN). Metabolitos separados em 400 µ l/min e o seguinte gradiente: 1 min 99% do buffer A, 11-min-gradiente linear de 99% do buffer A para 60% do buffer A, 13-min-gradiente linear de 60% do buffer À 30% do buffer A, 15-min-gradiente linear de 30% do buffer de A para 1% de tampão A, mantenha a concentração de 1% até 16 min. A partir 17 min, uso de gradiente linear de 1% do tampão A 99% do buffer A. re-equilibrar a coluna por 3 min, com 99% de concentração de tampão A antes da medição da próxima amostra. Aquisição de espectros de massa cobrindo o intervalo de massa entre 100 e 1500 m/z com resolução definida como 25.000 e carregamento tempo restrito a 100 ms. alvo de AGC conjunto para 1e6, tensão capilar de 3kV com uma bainha de gás fluxo e valor de gás auxiliar de 60 e 20 , respectivamente. Conjunto capilar temperatura de 250 ° C e skimmer tensão de 25V. 9. tratamento de dados Metabolomics Processo coletados cromatogramas adquiridas de ambos os modos de ionização. Usar o software para extrair a massa para a taxa de carga (m/z), tempo de retenção (RT) e intensidade dos picos associados, por exemplo, o software comercial (ver Tabela de materiais) ou alternativo24. Inicie o software de processamento clicando duas vezes no arquivo .exe Criar novo fluxo de trabalho, procurar atividade “Carga de arquivo” e mover esta atividade por “arrastar e soltar” para o espaço de fluxo de trabalho em branco. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, defina um nome do experimento no campo “Nome” e, em seguida, clique em “selecionados arquivos e pastas” e marcar os cromatogramas crus. Na guia que contém as configurações de “Avançado”, como “Corte de dados de perfil” intensidade 0. Clique em “Aplicar” e “Okey”. Procurar e adicionar atividade “Varredura de dados”. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, marque “Centroide dados” e “MS/MS”. Remova todos os dados de MS/MS, selecionando “Tudo” no painel de seleção. Procurar e adicionar a atividade “Cromatograma química ruído subtração”. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, marque “Cromatograma suavização” e definir número de varreduras para “3” e “Estimador” para “Moving média”. Defina “RT janela” de 51 e varreduras “Quantil” para 50%, subtração “Método” e intensidade 750 “Limiar”. Na guia que contém as configurações de “Avançado”, marque “RT remoção de estrutura” e defina “Comprimento mínimo de RT” para 5 exames. Na guia que contém as configurações “Avançadas”, marque “m/z remoção de estrutura” e defina “Mínimo m/z comprimento” para 3 pontos. Procurar e adicionar a atividade “Cromatograma RT alinhamento”. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, como “Esquema de alinhamento” a “Pairwise alinhamento Base árvore” e ‘Intervalo de pesquisa RT’ 0,5 min. Na guia que contém as configurações de “Avançado”, use parâmetros padrão. Procurar e adicionar a atividade “Detecção de pico” no grupo “Cromatograma” de atividades. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, na posição “Somatório janela” 0,09 min, “Minimum Size do pico” a 0,03 min, “Mesclar distância máxima” para 5 pontos e a “Estratégia de Mesclar” para “Centros”. Na “Pico RT separação” caixa conjunto “Gap/pico Ratio” para 50%. Na guia que contém as configurações de “Avançado”, defina “Suavização de janela” para 5 pontos, “Limite de refinamento” para 80% e “Limite de consistência” para 1. Definir o “Centro de computação” como “Intensidade-ponderado” com “Limiar de intensidade”, fixado em 70%. Procurar e adicionar a atividade “Isótopo Clustering” no grupo “Cromatograma” de atividades. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, defina “Tolerância RT” para min 0,015 e “m/z tolerância” de 5 ppm. Na guia contendo “Encaixe de Envelope” configurações, defina o “Método” como “Sem restrição de forma” e “Ionização” como “protonação (para a modalidade positiva) e”Deprotonação”(para o modo negativo). Conjunto “Minimum e Maximum cobram” para 1 e 4, respectivamente. Na guia que contém as configurações de “Avançado”, use parâmetros padrão. Procurar e adicionar atividade “Filtro de Singleton”. Para exportar os resultados do processamento de dados, procurar e adicionar a atividade “Analista” em “Exportar” grupo de atividades. Na guia que contém as configurações de “Gerais”, defina o “Tipo” como “Clusters” e “Observáveis” como “Resumiu a intensidade”. Escolha “Custom destino” e especifique o diretório do arquivo de exportação. Na guia que contém as configurações de “Avançado”, use parâmetros padrão. Anote a massa características usando banco de dados de referência-composto in-house. Analise um ou vários grau de MS referência-composto usando UPLC-Sra. uso o mesmo método de LC-MS para análise de referência-compostos e seus metabolitos co purificados com proteína de interesse.Nota: Para este estudo, um conjunto de quase 300 dipeptídeos foi analisado e usado como biblioteca de referência-composto. Análise de uso (ver Tabela de materiais) software para abrir arquivo cromatograma cru e Pesquisar para específico m/z e RT associada com medida de referência-composto (consulte o guia do usuário).Nota: Metabólitos secundários diferem em tipos de ionização. Verificar a presença do comum adutos pesquisando para um íon de massa igual a M-1.007276, M + 1.007276, 18.033823 M + e M + 22.989218 [M-H], [M + H], [M + NH4] e [M + at], respectivamente. Uso de planilha para abrir exportado arquivo “Analista” obtido após o processamento de cromatogramas e busca de íon específico em massa. Compare o RT da característica massa medida no experimento e RT do composto de referência. Permitir que um desvio de 0.005 Da m/z e 0,1 min para RT Para testar a importância do enriquecimento do metabólito co purificado com proteína em particular entre as amostras (linha com proteína Blumental de controle de interesse vs EV), comparar valores de pico usando teste t do não-pareado Student bicaudal seguido por múltiplo correção de comparação (por exemplo Benjamini & Hochberg falsa descoberta taxa correção ou correção de Bonferroni).