Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l’analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.
Processi cellulari sono regolati dalle interazioni tra molecole biologiche come proteine e metaboliti acidi nucleici. Mentre l’indagine sulle interazioni proteina-proteina (PPI) è una novità, approcci sperimentali con l’obiettivo di caratterizzare le interazioni della proteina-metabolita endogeno (PMI) costituiscono uno sviluppo piuttosto recente. Qui, presentiamo un protocollo che consente la simultanea caratterizzazione del PPI e PMI di una proteina di scelta, di cui come esca. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per Arabidopsis cell culture e combina la purificazione di affinità (AP) con spettrometria di massa (MS)-base di rilevazione della proteina e del metabolita. In breve, linee transgeniche di Arabidopsis, che esprimono la proteina esca fusa a un tag di affinità, in primo luogo vengono lisate per ottenere un estratto cellulare nativo. Anticorpi anti-tag sono usati per tirare giù partner della proteina e del metabolita della proteina esca. I complessi purificato per affinità vengono estratti mediante un One-Step metil tert-butil etere (MTBE) / metanolo/acqua metodo. Mentre metaboliti separano in polare o la fase idrofoba, proteine possono essere trovate nel pellet. Entrambi i metaboliti e proteine vengono poi analizzate tramite spettrometria della cromatografia-massa liquida ultra-prestazioni (UPLC-MS o UPLC-MS/MS). Linee di controllo di vuoto-vector (EV) vengono utilizzati per escludere falsi positivi. Il vantaggio principale del nostro protocollo è che esso consente l’identificazione dei partner della proteina e del metabolita di una proteina dell’obiettivo in parallelo in condizioni di quasi-fisiologiche (lisato cellulare). Il metodo proposto è semplice, veloce e può essere facilmente adattato a sistemi biologici diversi da colture di cellule vegetali.
Il metodo qui descritto mira all’identificazione di partner metabolita e proteina di una proteina di scelta in condizioni di lisato cellulare vicinoin vivo . Si è ipotizzato che molti metaboliti più che caratterizza oggi hanno un’ importante funzione regolatrice1. Metaboliti possono fungere da interruttori biologici, cambiando l’attività, la funzionalità e/o la localizzazione di loro recettore proteine2,3,4. Nell’ultimo decennio diversi metodi di innovazione, che consente di identificare delle PMI in vivo o in condizioniin vivo vicino, sono stati sviluppati5. Approcci disponibili possono essere separati in due gruppi. Il primo gruppo comprende tecniche che iniziano con un noto-metabolita esca per intrappolare partner nuova proteina. Metodi includono cromatografia di affinità6, droga affinità reattivo destinazione-stabilità test7, chemio-proteomica8e proteoma termica9di profilatura. Il secondo gruppo è costituito da un singolo metodo che inizia con una proteina nota per identificare piccole molecole leganti10,11.
AP accoppiato con lipidomica basati su MS è stato utilizzato per analizzare i complessi proteina-lipide in Saccharomyces cerevisiae12. Come punto di partenza, gli autori hanno usato i ceppi di lievito che esprimono 21 enzimi coinvolti nella biosintesi dell’ergosterolo e 103 chinasi fuse con una purificazione di affinità tandem (TAP) tag. 70% degli enzimi e il 20% delle chinasi sono stati trovati per associare diversi ligandi idrofobici, mettendo in luce la rete di interazione proteina-lipide intricati.
In precedenza, potremmo dimostrare che, similmente ai lipidi, composti polari e semi-anche rimangano legati a complessi della proteina isolati dai lisati cellulari13. Basato su questi risultati, abbiamo deciso di ottimizzare l’AP metodo precedentemente pubblicato10,11 tra cellule vegetali e composti idrofili14. Per questo scopo, abbiamo utilizzato vettori TAP descritti da Van Leene et al. 2010, utilizzato con successo nella pianta PPI studi15. Per accorciare il tempo necessario per ottenere linee transgeniche, abbiamo deciso su colture cellulari di Arabidopsis. Abbiamo impiegato un One-Step metil tert-butil etere (MTBE) / metanolo/acqua estrazione metodo, permettendo la caratterizzazione delle proteine (pellet), lipidi (fase organica) e metaboliti idrofili (fase acquosa)16 in una singola esperimento di purificazione di affinità. Linee di controllo di EV sono stati introdotti per escludere falsi positivi, ad esempio proteine leganti al tag da solo. Come prova di concetto siamo taggati tre (di cinque) delle chinasi del nucleoside difosfato presentano nel genoma di Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Tra altri reperti, potremmo dimostrare che NDPK1 interagisce con il glutatione S-transferasi e del glutatione. Di conseguenza potremmo dimostrare che NDPK1 è sottoposto a glutationilazione14.
Per riassumere, il protocollo presentato è un importante strumento per la caratterizzazione di proteine e reti di interazione della proteina-piccolo-molecola e costituisce un importante passo in avanti rispetto ai metodi esistenti.
Il protocollo presentato permette l’identificazione parallela di PP e PM complessi di una proteina dell’obiettivo. Dalla clonazione ai risultati finali, l’esperimento può essere completato in appena 8-12 settimane. Completa AP prende circa 4-6 h per un set di 12 a 24 campioni, rendendo il nostro protocollo adatto per analisi di rendimento medio.
Il protocollo, pur essendo nel complesso semplice, ha un numero di passaggi critici. (i) sufficienti quantità di proteina input e branelli di affinità è cruciale per raggiungere una gamma dinamica di rilevamento del metabolita. Lisi cellulare efficiente sono quindi un passo cruciale nella procedura. Proteina poveri rendimenti possono essere una conseguenza dell’insufficiente polverizzazione del materiale o di non ottimale rapporto di lisi-buffer/materiale. (ii) dovrebbe prestare attenzione che i reagenti utilizzati sono MS-friendly. Detergenti aggressivi, glicerolo o una quantità eccessiva di sale dovrebbe essere evitata come interferiscono con rilevazione di MS. (iii) dell’agarosi branelli non dovrebbero essere eccessivamente secchi durante fasi di lavaggio, e quando si utilizza un collettore sottovuoto è importante applicare un tasso di flusso lento così come non per distruggere i branelli o influenzare la stabilità del complesso.
Ci sono alcune importanti modifiche possibili al protocollo presentato: (i) usiamo il promotore CaMV35S costitutivo per massimizzare la quantità di proteina esca. Sovraespressione, mentre molto utile, può avere gravi effetti sulla cella omeostasi28 e portano alla formazione di interazioni fisiologicamente irrilevante. Espressione di proteine etichettate utilizzando promotori nativi e dove possibile in una priorità bassa di perdita-de-funzione è considerata superiore per il recupero veri Interactiani biologici. Per le proteine non normalmente espresse in colture di cellule vegetali, una priorità bassa della pianta può rivelarsi necessaria per identificare gli interattori pertinenti. (ii) quando si lavora con proteine di membrana, il buffer di Lisi deve essere completata con un detergente compatibile con MS. (iii) l’introduzione di una seconda fase di purificazione di affinità potrebbe migliorare falsi positivi al rapporto di vero-positivi ed eliminano la necessità per EV controlli29. Un tag romanzo tandem con due siti di proteasi-taglio indipendente presenta un’alternativa attraente per il passo di cromatografia di esclusione dimensionale aggiunto da Maeda et al 201411, che è sia laboriosa e che richiede tempo.
L’inconveniente più grave dell’AP è l’alto tasso di falsi positivi. Le ragioni sono numerose. Sovraespressione costitutiva è stato già citata. Un’altra fonte di interazioni fisiologicamente irrilevante, a meno che lavorando con gli organelli isolati, è la preparazione di lisati di cellule intere contenenti miscele di proteine e metaboliti da diversi compartimenti subcellulari. Localizzazione sottocellulare dovrebbe essere utilizzata per filtrare gli Interactiani veri. Tuttavia, la maggior parte dei falsi positivi dovuti a aspecifici associazione tra proteine e resine di agarosio. Introduzione di una seconda fase di purificazione, come descritto in precedenza, offre la migliore soluzione al problema, tuttavia è disponibile al costo di tempo e velocità effettiva. Inoltre, più debole interazione può essere perso come si allunga il protocollo. Un altro avvertimento di AP è che, nonostante le informazioni complete che fornisce sui Interactoma di una proteina bersaglio, differenziando tra obiettivi diretti e indiretti della proteina innescato è impossibile. Sono necessari approcci bimolecolari mirati per confermare interazioni.
AP accoppiato con metabolomica basata su MS-è stata usata per studiare i complessi della proteina in S. cerevisiae12. Quest’opera, insieme a nostra osservazione precedente13 che, similmente ai lipidi, composti polari e semi-rimangano legati a complessi della proteina isolati da lisati cellulari, fornito basi concettuali per il protocollo presentato. Il nostro protocollo è caratterizzato da tre punti: (i) In opposizione al lievito lavorare12, dimostra che AP è adatto per il recupero non solo ligandi di proteine idrofobiche ma anche idrofili. (ii) con l’introduzione di un protocollo di estrazione di tre-in-one, un singolo punto di accesso consente di studiare la proteina ed il metabolita interattori della proteina esca. (iii) abbiamo adattato il protocollo per cellule vegetali.
Gli sforzi futuri si concentreranno sulla creazione di un tag di romanzo tandem con due siti di proteasi-taglio indipendente. Vorremmo anche esplorare l’idoneità del protocollo a basso-abbondanza di piccole molecole quali ormoni vegetali.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare gentilmente Dr. Lothar Willmitzer per il suo coinvolgimento nel progetto, discussioni produttive e grande vigilanza. Siamo grati al Dr. Daniel Veyel per aiutare con le misure di MS di proteomica. Apprezziamo la signora Änne Michaelis che ci ha fornito prezioso aiuto tecnico con misurazioni di LC-MS. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. Monika Kosmacz e Dr. Ewelina Sokołowska per l’aiuto e il coinvolgimento nel lavoro sul manoscritto originale e di Weronika Jasińska per il supporto tecnico.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |