JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

אפיון מיקרוביאלית של חומרים מתקדמים ליישומים בביו-הנדסה

Published: August 04, 2018
doi:
10.3791/57710
, ,
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales,Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir

Summary

אנו מציגים פרוטוקול עבור אפיון חומרים מתקדמים מיקרוביאלית. . הנה, פעילות מיקרוביאלית על משטחים גשמי נמדד על ידי שתי שיטות שבהן משלימים אחד את השני: אחד המבוסס על הבדיקה דיפוזיה של הדיסק אגר, והשני הוא תהליך סטנדרטי מבוסס על הנורמה 22196:2007 ISO.

Abstract

הפיתוח של חומרים מתקדמים חדשים עם תכונות משופרות הופך יותר ויותר חשוב במגוון רחב של יישומים בביו-הנדסה. לכן, רבים biomaterials הרומן להיות נועדו לחקות ובסביבות ספציפיות הדרושות עבור ביו יישומים כגון הנדסת רקמות, תרופות מבוקרת. הפיתוח של חומרים בעלי תכונות משופרות קיבעון של תאים או אנזימים הוא גם נושא המחקר הנוכחי בהנדסה bioprocess. אולם, אחד המאפיינים המבוקשות ביותר של חומר ביישומים אלה הוא הקיבולת מיקרוביאלית כדי למנוע זיהומים לא רצויים. בשביל זה, אנו מציגים easy-to-בצע פרוטוקולים עבור אפיון חומרים בהתבסס על מבחן דיפוזיה (i) דיסק אגר (שיטת דיפוזיה) ו (ii) הנורמה 22196:2007 ISO כדי למדוד את פעילות מיקרוביאלית על משטחים גשמי (קשר מיקרוביאלית השיטה). פרוטוקול זה חייב להתבצע באמצעות חיידקים גראם גראם שליליים ושמרים לכיסוי טווח רחב של מיקרואורגניזמים. לדוגמה, חומרים 4 עם הטבע כימיים שונים נבחנים ע פ הפרוטוקול הזה נגד Staphylococcus aureus Escherichia coli, קנדידה אלביקנס. התוצאות של בדיקות אלה התערוכה הלא-מיקרוביאלית לפעילות החומר הראשון והגברת הפעילות אנטיבקטריאלי נגד חיידקים גראם גראם שליליים עבור 3 החומרים האחרים. עם זאת, אף אחד מהחומרים 4 מסוגלים לעכב את הצמיחה של קנדידה אלביקנס.

Introduction

כישלון השתל היא לעתים קרובות תוצאה של זיהומים חיידקים להתרחש למרות טיפול מונע מיקרוביאלית ותנאי עבודה אספטי. בעיה זו היא גרימת הוצאות הבריאות גבוהה מאוד והיא מצער בקרב חולים1. חיידקים חשובים כגון Staphylococcus aureus כיום נחשבים מאוד מסוכן פתוגנים זיהומים nosocomial הקשורים קטטרים שתלים רפואיים אחרים, המזהמים העיקריים של מכשירים רפואיים2. לפיכך, הפיתוח של אסטרטגיות מיקרוביאלית הרומן הוא צורך דחוף לשימושים יומי והן רפואי.

סוכני מיקרוביאלית לכלול אנטיביוטיקה3, תרכובות אמוניום רביעון4, יונים/תחמוצות מתכת5ומיקרוביאלית פפטידים (אמפר)6. אנטיביוטיקה בהדרגה הופכים פחות יעיל עקב עמידות חיידקים7, אשר נמצאת בעלייה עקב שימוש יתר באנטיביוטיקה8. רביעון אמוניום תרכובות הם מאוד יעיל לשימוש לטווח קצר רק בגלל ההתנגדות מיקרוביאלית9. יונים/תחמוצות מתכת יש זמן מנוצל כמו סוכני מיקרוביאלית יעיל מאוד, משמשים רבות מוצרים מסחריים נפוצים כמו תחבושות, מסנני מים, צבעים, ועוד10,11,12. עם זאת, זה הוכח כי סוגי תרכובות אלה יכול להיות רעיל כמה סוגים של תאים בתרבית של13.

מגברים להראות מיקרוביאלית מעולה ו immunomodulatory-מאפיינים-14,–15, חיידקים מצליח למצוא אותו קשה מאוד לפתח עמידות נגדם16. עם זאת, התהליך כדי לייצר אמפר טהור יקר; לכן, הפקה בקנה מידה גדול אינה ברת קיימא. לפיכך, אסטרטגיות מונה הבעיות בהפקת אמפר כבר פיתח (למשל, קטן peptoid אנטיבקטריאלי מולקולרית מחקה17, peptoids18, α-פפטידים19 ו β-פפטידים20). Polypeptides methacrylate הסתיימה, polypeptoids יש כבר מסונתז ציפויים נוגדי חיידקים, antifouling21.

התפתחות חדשה antimicrobial סוכנים כגון חומרים מתקדמים בטהור או טופס היברידית, מסוגלים למנוע ולטפל זיהומים multidrug עמידים, נחוץ יותר ויותר. מגוון רחב של חומרים מתקדמים חדשים עבור שדות בביו-הנדסה רבים כגון רקמות bioprocess פותחו עם מאפיינים כימיים ופיזיים משופרת העשורים האחרונים באמצעות מספר שיטות: פלזמה-הפילמור הרכבה על גבי המצע הידרופובי22,23,24, תפירה של crosslinking צפיפות25,26, הפילמור פתרון27,28,29 , 30, porogen פירוק31,32, על ידי שילוב של ננו-חומרים כגון גראפן אוקסיד (קדימה)33,34,35,36 , פחמן nanofibers (CNFs)37.

המחקר של הקיבולת מיקרוביאלית של חומרים חדשים אלה יכול להגדיל אקספוננציאלית הישימות בביו-הנדסה הפוטנציאלי שלהם, לכן, הפך חיוני. אנו מציגים פרוטוקול easy-to-בצע לכמת את פעילות מיקרוביאלית של חומרים מתקדמים חדשים כאלה. כאן, לאחר הכנת המדגם, שתי שיטות משלימות עוקבים: הראשון הוא מבוסס על אגר דיסק דיפוזיה מבחן38 (שיטת דיפוזיה) והיא השנייה מבוססת על ISO 22196:2007 הנורמה39 כדי למדוד את פעילות מיקרוביאלית משטחים גשמי (שיטת קשר).

Protocol

1. הכנת הדוגמא חותכים הדגימות גשמי דיסקים בקוטר 10 מ מ בקוטר 10 מ מ אגרוף גלילי.הערה: חומרים שבירות יכול להיות מרוכך בממיסים סטרילי מתאים עבור 1 h ולאחר מכן לחתוך לתוך דיסקים. לדוגמה, הידרופילית חומרים כגון אבץ alginate נבדקו בעקבות פרוטוקול זה, היו לחלח במים בלוק לפני חיתוכם על מנת למנוע שבירת מדגם. עם זאת, חומרים הידרופובי אחרים כגון poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) לא צריך כל סוג של נפיחות הקודם על מנת לחתוך כראוי. יבש את הדיסקים גשמי מדגם ב 60 מעלות צלזיוס בתנור ואקום (< 10-2 טנדר של גוה של) במשך 24 שעות ביממה.הערה: כמה חומרים עשוי להזדקק ייבוש חום גבוה. עם זאת, חשוב לא להגיע לטמפרטורה זה תרמית יכול לבזות את החומר. למדוד את עוביים גשמי הסרט עם caliper דיגיטלית.הערה: פרוטוקול זה ממליצה הניצול של סרטים גשמי עם עוביים קבוע ו דומים כאשר משווים את פעילות מיקרוביאלית של חומרים שונים. לעקר כל הדגימה על ידי טבילה אתנול 70% למשך 10 דקות, לאחר מכן קרינה אולטרה סגולה (UV) עבור h 1 לכל צד.הערה: קרינת UV יכולה להתבצע הצבת כל הדגימה בצלחת פטרי סטריליות בתוך תא למינארי עם מנורה W 12.0 של קרינת UV-C.התראה: חוקרים צריכים לא לחשוף את עצמם כדי קרינת UV, כי זה מוטגניות. בצע שלבים 1.1, 1.2, 1.3 ו 1.4. עם הדיסקים גשמי שליטה.הערה: פוליאתילן terephthalate (PET) או חומרים שאינם-מיקרוביאלית חלופי יכול לשמש כדיסקים שליטה בשיטה דיפוזיה ואנשי קשר. יתר על כן, כאשר אפיון nanocomposites או חומרים שטופלו, חומר הבסיס אמור לשמש כחומר שליטה. 2. מומלץ מיקרואורגניזמים הערה: אנו ממליצים על השימוש של מיקרואורגניזמים שונים 3 ללמוד את קיבולת מיקרוביאלית של החומר נבדק נגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים. השתמש תרבויות טהור של מיקרואורגניזמים 3: חיידקים גראם חיוביים Staphylococcus aureusחיידקים גראם שליליים Escherichia coli, השמרים קנדידה אלביקנס.הערה: מינים מיקרואורגניזם אחרים יכולים גם להיבדק עם פרוטוקול זה על-ידי שינוי התנאים הדגירה במידת הצורך.התראה: חייב להיות במעקב המדידות אבטחה הנדרש בהתאם לסוג של מיקרואורגניזם המועסקים פרוטוקול זה. לעבוד עם חומר סטרילי מראש או בלוק ולהשתמש מבער בונזן במהלך כל התהליך של המניפולציה מיקרוביאלי או ארון בטיחות ביולוגית (במקרה הצורך) כדי להבטיח תנאים אספטי.הערה: מומלץ אוטוקלב התנאים 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על מדיומים תרבות ו- 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להפוך את העבודה חומר שאריות ביולוגיות. 3. אגר דיסק מבחן דיפוזיה (שיטת דיפוזיה) הערה: כאשר דיפוזיה נוזלי של תרכובות מיקרוביאלית יכול להיות המנגנון העיקרי מיקרוביאלית של חומרים מתקדמים, השיטה דיפוזיה יכול לספק מידע שימושי מאוד לגבי הקיבולת מיקרוביאלית של חומרים אלה. הדיסק גשמי ממוקם במרכז צלחת אגר יכול ליצור אזור שקוף טבעת (halo) שבו עיכוב גדילה של מיקרואורגניזמים מתרחשת לאחר 24 שעות של תרבות (ראה איור 1). דיפוזיה בדיקת נוהל היכונו, החיטוי tryptic סויה אגר (TSA) ההוראות של היצרן. יוצקים שהתיקים עקר פטרי בתנאים aseptic באמצעות מבער בונזן או תא למינארי.הערה: הלוחות TSA חייב להיות 4-6 מ מ עובי. תרבות של מיקרואורגניזמים שונים כדי להבדק aerobically 18 – 24 ש ח בחודש צלחות פטרי עם TSA באינקובטור ב 37 º C. היכונו, ציר סויה tryptic autoclave (TSB) ההוראות של היצרן. יוצקים את TSB בשפופרת צנטרפוגה מראש מעוקרות 50 מ עם פיפטה סרולוגית מראש מעוקרות בתנאים aseptic באמצעות מבער בונזן או תא למינארי. Resuspend כמה מושבות של שלב 3.1.3 ב 25 מיליליטר TSB הכלול שפופרת צנטרפוגה סטרילי באמצעות מטלית כותנה סטרילי מערבולת אותם 1 דקות להשיג ערבוב אחיד. התאם את ספיגת (ב- 540 nm) של התרבות עם ספקטרופוטומטרים מספר מתאים של המושבה יוצרי יחידות (CFU) לכל mL: כ 1.5 x 108 CFU/mL עבור חיידקים, עונה 1 פרק 10-6 5 x 106 CFU/mL שמרים.הערה: יש לבחור את אמצעי האחסון תרבות, cuvette כדי למדוד את ספיגת בהתאם לסוג ספקטרופוטומטרים מנוצל. מערבולת שהמרק מיקרוביאלי למשך 5 שניות כדי לשפר את הפיזור מיקרואורגניזם ויציפו בקצרה ספוגית כותנה סטרילי הזה ההשעיה מיקרוביאלי. להסיר את עודף של נוזלים מן הדגימה על ידי לחיצה הקיר שפופרת המכילה את התרבות. באופן שווה, צובעות ההשעיה מיקרוביאלי מרק עם אוזניים סטרילי על גבי משטח הלוחיות TSA ב 3 מטוסים כדי לכסות את פני השטח כולו שלהם עם בקטריה והנח לו להתייבש במשך 5 דקות לאחר חיסון.הערה: להסרת לחות, הלוחות TSA יש להציב פתוח במצב הפוך ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות לפני חיסון. לחטא זוג מספריים על-ידי ממליצים להם גביע עם אתנול 96% ואז בוער אותם עם מבער בונזן או אלכוהול צורב. מקם את הדיסקים מדגם להיבדק ולשלוט דיסק במרכזו של הלוחות TSA באמצעות זוג מלקחיים סטרילי. דגירה aerobically הלוחות TSA בעמדה הפוכה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.הערה: כדי למנוע כל סיכון לזיהום, מומלץ דגירה הלוחות TSA בעמדה הפוכה. עם זאת, אם הדיסק מדגם לניתוק מן הלוחות TSA, אין לבצע שלב זה בעמדה הפוכה. במקרה זה, מומלץ לייבש את הצלחות בשכונה זרימה שכבתית. בדיקה מיקרוביאלית זו יש לבצע לפחות ב- quadriplicate בימים שונים כדי להבטיח הפארמצבטית. בדיקת ריכוז חיידקים ההשעיה וטוהרהערה: השלבים הבאים נחוצים על מנת לבדוק ריכוז חיידקים שנקבעו עם ספקטרופוטומטרים בשלב 3.1.7 שהפרטים נכונים, שנועדה אין זיהום סביבתי מיקרוביאלי. זיהום סביבתי מיקרוביאלי ניתן להבחין בקלות על ידי הופעתו של סוגים שונים של מושבות חיידקים לאחר 24 שעות של תרבות. יתר על כן, אין זיהום מיקרוביאלי של המדיום TSB במהלך המניפולציה שלה בדילולים טורי עשרוני והקפדה עם צלחת שליטה TSB שלילי. לוותר על TSB סטרילי (להכין בשלב 3.1.4) לתוך צינורות סטרילי microcentrifuge באמצעות micropipette עם טיפים בלוק מתאים בתנאים אספטי. אחד מהם להיות מנוצל כפקד TSB שלילי. ביצוע דילולים טורי עשרוני עם המתלה מרק מיקרוביאלי מנוצל בשלב 3.1.9 צינורות סטרילי microcentrifuge המכיל TSB. מורחים µL 100 של כל דילול על צלחות TSA בעזרת מרית Drigalski מראש מעוקרות או מכשיר חלופי. גם להתפשט μL 100 TSB בינוני ללא מיקרואורגניזם (להכין בשלב 3.2.1) על צלחת TSA כמו צלחת שליטה TSB שלילי. דגירה aerobically הלוחות TSA aerobically ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. לספור את מספר מושבות לבדוק כי CFU/mL דומים לזה שנקבע בשלב 3.1.7. בדוק שאין שום זיהום סביבתי חיידקים על לוחות TSA עם סוג אחד בלבד של המושבות. בדוק שאין שום זיהום מיקרוביאלי בצלחת שליטה שלילי TSB מציג אין מושבות 4. מדידת פעילות מיקרוביאלית על משטחים גשמי (שיטת קשר) הערה: כאשר משטח מגע יכול להיות המנגנון העיקרי מיקרוביאלית של כמה חומרים מתקדמים, שיטת קשר יכול לספק מידע שימושי מאוד לגבי הקיבולת מיקרוביאלית של חומרים אלה. בשיטה זו, המיקרואורגניזמים ממוקמים ישירות על גבי השטח גשמי, עיכוב הצמיחה שלהם יכול להיקבע לאחר משך זמן מסוים. הליך ראשוני היכונו, החיטוי TSB ההוראות של היצרן. יוצקים את TSB בשפופרת צנטרפוגה מראש מעוקרות 50 מ עם פיפטה סרולוגית מראש מעוקרות בתנאים aseptic באמצעות מבער בונזן או תא למינארי. תרבות מיקרואורגניזמים שונים להיבדק aerobically בין לילה בצינור עם TSB שייקר מסלולית (140 סל ד) ב 37 º C. לדלל את התרבות לילה ב- 20 מ של TSB בשפופרת צנטרפוגה מראש מעוקרות 50 מ ל כדי ריכוז של 106 CFU/mL (שנקבעו עם ספקטרופוטומטרים-540 nm).הערה: יש לבחור את אמצעי האחסון תרבות, cuvette כדי למדוד את ספיגת בהתאם לסוג ספקטרופוטומטרים מנוצל. ביצוע דילולים טורי עשרוני של תרבות זו צינורות סטרילי microcentrifuge המכיל TSB. התפשטה µL 100 של התרבות על צלחות TSA, דגירה זה aerobically ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. לספור את מספר המושבות כדי להבטיח ריכוז של תא הראשונית של 1 x 106 CFU/mL מקום 4 דיסקים שליטה לספירת חיידקים לאחר 24 שעות של 4 דיסקים מדגם של כל סוג של החומרים שנבדקו לספירת חיידקים לאחר 24 שעות ביממה במפריד בארות של צלחת 48-ובכן סטרילי. פיפטה µL 150 של ההשעיה חיידקים על גבי כל שטח דיסק. חיידקים סומכים את הפיקוח ואת החומרים שנבדקו (לאחר 24 שעות) לאחר שלב 4.1.6, aerobically דגירה 4 מדגם הדיסקים שנותרו בצלחת. ובכן 48-37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.הערה: יכול להיות שונה הפעם דגירה 24 שעות ללימוד עיכוב גדילה עת ארוכה או קצרה יותר. לאחר 24 שעות של דגירה, פיפטה µL 850 של PBS סטרילי על גבי המשטח של הדיסקים לדוגמה 4 ומערבבים אותו עם µL 150 של ההשעיה מיקרוביאלי. לאסוף את התערובת ההשעיה PBS/חיידקים בכל דיסק מהצלחת 48-ובכן ומעבירים אותם אל צינור מראש מעוקרות 10 מ”ל. מערבולת התערובת ההשעיה PBS/חיידקים, כל דיסק עבור 1 דקות, sonicate זה ב 50 הרץ עבור 5 דקות ו מערבולת זה שוב 1 דקות להבטיח כי אין מיקרואורגניזמים קיימא יישארו דבקה השטח גשמי. ביצוע דילולים טורי העשרוני של כל תרבות sonicated צינורות סטרילי microcentrifuge המכיל TSB להפיץ µL 100 של התרבות על צלחות TSA, דגירה זה aerobically ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. לספור את מספר מושבות, המהווים המספר של מיקרואורגניזמים קיימא על כל שטח הדיסק מדגם ושליטה. מבטאים את מספר התאים קיימא ב- (CFU/mL). רוצה לצלם כמה תמונות של התרבות חיידקים סופי עבור הדיסקים מדגם ושליטה. 5. ניתוח תוצאות מיקרוביאלית איור 1: מדידות עבור רוחב המנורמל של מיקרוביאלית “היילו”. לוח זה מראה את הקוטר של אזור עיכוב (dאיז) קוטר דיסק (d). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. ניתוח תוצאות שיטת דיפוזיה למדוד את הקוטר של אזור עיכוב (dאיז), קוטר דיסק (d) (ראה איור 1) עם caliper דיגיטלית.הערה: עיכוב אזור או נוגדי חיידקים “היילו” נוצר בעקבות עיכוב צמיחת חיידקים המיוצר על ידי הדיסק גשמי מיקרוביאלית (ראה איור 1). ניתן לצפות כי יש אזור הטבעת שקוף קרוב המדגם בהשוואה לשאר הצלחת היכן המיקרואורגניזמים גדלו כראוי (אזור אטום). לקבוע את רוחב מנורמל מיקרוביאלית “הילה” (nwהילה) של כל דיסק על-ידי החלת משוואה (1).(1) לקבוע את וסטיית של רוחב המנורמל של הערכים nwהילה מיקרוביאלית “היילו” עם 4 נקבע כל דגימה. רוצה לצלם כמה תמונות של התרבות חיידקים סופי עם הדיסק גשמי.הערה: הקוטר של אזור עיכוב (dאיז), קוטר דיסק (d) ניתן גם למדוד מן התצלום נלקח בשלב 5.1.4 באמצעות דימוי ראוי בתוכנת עיבוד. ניתוח תוצאות שיטת קשר לקבוע את המספר של מיקרואורגניזמים קיימא החלים על פי משוואה (2).(2)הערה: כאן, N הוא המספר של מיקרואורגניזמים קיימא התאושש לכל ס מ2 לכל בדיקת הדגימה; C הוא הרוזן צלחת; D הוא הגורם דילול; A הוא שטח הפנים של הדגימה הבדיקה ס מ2 נקבע עם קוטר דיסק הדגימה. לקבוע את אובדן הכדאיות (LV) כדי לשקף עיכוב של צמיחת תאים על-ידי החלת משוואה (3).(3)הערה: כאן, C הוא המספר הממוצע של קיימא מיקרואורגניזמים (N) CFU/mL•cm2, התאוששה דגימות הבקרה לאחר 24 שעות; S הוא המספר של קיימא מיקרואורגניזמים (N) CFU/mL•cm2, התאוששה דגימות הבדיקה לאחר 24 שעות. לקבוע את וסטיית של אובדן יכולת הקיום עם 4 ערכי LV(%) נחוש של כל דגימה.

Representative Results

פרוטוקול זה היה מועסק, כדוגמה, כדי לבדוק את קיבולת מיקרוביאלית של חומרים 4 עם הטבע כימיים שונים נגד 3 מומלץ מיקרואורגניזמים: Staphylococcus aureus Escherichia coli, קנדידה אלביקנס . התוצאות של הבדיקות דיפוזיה דיסק אגר (שיטת דיפוזיה) הציג פעילות מיקרוביאלית שאינם עבור החומר הראשון (M1) שהתרחשה בדיסק שליטה (C, התמונה לא מוצג) והגברת הפעילות אנטיבקטריאלי נגד גראם גראם שליליים חיידקים על 3 החומרים האחרים M2, M3, M4 (ראה איור 2). איור 2: תוצאות שיטת דיפוזיה מיקרוביאלית. לוח זה מראה את שיטת דיפוזיה מיקרוביאלית עבור 4 גשמי (M1, M2, M3, M4) הדיסקים (קוטר 10 מ מ x 1 מ מ עובי) נגד S. aureus ו e. coli לאחר 24 שעות של דגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 מראה את רוחב מנורמל אחרת מיקרוביאלית “היילו” (nwהילה) עבור דוגמה שונים החומרים M1, M2, M3, M4 נגד חיידקים גראם גראם שליליים מחושב עם המשוואה (1). עם זאת, אף אחד מהחומרים 4 הצליחו לעכב את הצמיחה של השמרים קנדידה אלביקנס (לא הראו תמונות). איור 3: תוצאות דיפוזיה מיקרוביאלית “היילו”. לוח זה מראה את מנורמל “היילו” (nwהילה) עבור כל גשמי (M1, M2, M3, M4) דיסק (קוטר 10 מ מ x 1 מ מ עובי) נגד S. aureus ו e. coli לאחר 24 שעות של דגירה. ההבדלים הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p < 0.01). עם זאת, מדגם M1 הציג שום פעילות מיקרוביאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. התוצאות של השיטה קשר גם הציג פעילות מיקרוביאלית שאינם עבור החומר הראשון (M1) שהתרחשה שליטה הדיסק (C), הגדלת אנטיבקטריאלי נגד Grampositive, חיידקים גראם שליליים עבור 3 החומרים האחרים (ראה איור 4). איור 4: מיקרוביאלית צור בשיטה התוצאות. לוח זה מראה צלחות בהתאמה 90 מ מ 4 גשמי (M1, M2, M3, M4) משטח פעילות מיקרוביאלית וזמינותו לפי 22196:2007 ISO לאחר 24 שעות של דגירה עבור S. aureus ו- e. coli (דילול פקטור של 10-4). C הוא החיידק קיימא התאוששה הדיסק שליטה לאחר 24 שעות של דגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. האובדן של הכדאיות (%) נקבע על ידי משוואה (2) ו- (3) כמצוין בפרוטוקול זה (ראה איור 5). איור 5: אובדן של הכדאיות בשיטה קשר. לוח זה מראה את אובדן הכדאיות (%) עבור M1, M2, M3, M4 נגד S. aureus ו e. coli על משטחים גשמי. מדגם M1 הציג שום פעילות מיקרוביאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. עם זאת, אף אחד מהחומרים 4 הצליחו לעכב את הצמיחה של השמרים קנדידה אלביקנס בשיטת קשר גם (לא הראו תמונות). לכן, 3 של חומרים מתקדמים 4 אלה הראו תוצאות חיוביות מיקרוביאלית נגד חיידקים גראם גראם שליליים, ולכן יכול להיות מאוד שימושי עבור יישומים רבים בביו-הנדסה עם דרישות גבוהות אנטיבקטריאלי. עם זאת, אף אחד מהחומרים 4 הצליחו לעכב את הצמיחה של שמרים.

Discussion

ניתן לנתח את פעילות מיקרוביאלית של חומרים מתקדמים חדשים על ידי פרוטוקול זה easy-to-בצע בהיקף של 2 נהלים משלימים המבוסס על שיטות קיימות 2: אגר דיסק פעפוע38 ולבחון פעילות מיקרוביאלית נמדדים על המשטחים גשמי לפי הנורמה 22196:2007 ISO39.

בתחום מחקר זה, רבים מן הבדיקות מיקרוביאלית דיווחו בספרות הם תלויי-assay מאוד. לכן, זה מאוד חשוב יש מפורט ועקבית פרוטוקולים במקום מעבר מעבדות. המאמר זה צעד בכיוון הזה. יתר על כן, זה יכול להיות מאוד מועיל עבור חוקרים רבים פחות מנוסים בתחום הזה ולא דורשים תהליכי עומק, שלב אחר שלב כדי לעקוב אחר עבור תוצאות מדויקות.

פרוטוקול זה יכול לשמש עם סוגים רבים של חומרים לחתוך לצורות דיסק של 10 מ מ קוטר. חומרים שבירות יכול נפוחות ב ממס מתאים עבור h 1 כדי להפוך את תהליך חיתוך קל יותר. לפיכך, ניתן hydrated הידרופילית חומרים כגון alginates במים מזוקקים בלוק. ממיסים אחרים, כגון אתנול, קטון דיכלורומתאן, יכול להיות מועסק להתנפח הידרופובי חומרים עבור 1 h לפני חיתוכם. עם זאת, כמה חומרים כגון poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) לא צריך להיות נפוחות, הם יכולים להיות לחתוך ישירות. לאחר מכן, חשוב מאוד יבש הדיסקים גשמי מדגם בתנור ואקום, לעקר כל הדגימה עם אתנול, קרינת UV מאובטח כדי למנוע כל סיכון לזיהום.

פרוטוקול זה ממליצה TSA TSB כמו תרבות המדיה ושימוש של תרבויות טהור של מיקרואורגניזמים 3 להגיע למגוון רחב של מיקרואורגניזמים: חיידקים גראם חיוביים Staphylococcus aureus, חיידקים גראם שליליים Escherichia coli, את השמרים קנדידה אלביקנס. עם זאת, התקשורת תרבות אלטרנטיבית ומיקרואורגניזמים אחרים הזקוקים תנאים שונים הדגירה יכול לשמש גם עם פרוטוקול זה. לפעמים, רק 1 מיקרואורגניזם נבדק שיש לי מושג ראשוני של פעילות מיקרוביאלית של חומר חדש.

החומרים מציג פעילות מיקרוביאלית חזקה נגד 3 המומלץ שונים סוגי מיקרואורגניזמים צריך להיבדק גם נגד פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה כגון סטפילוקוקוס עמיד methicillin- סטפילוקוקוס epidermidis (MRSE), אשר כבר נעזרו בהצלחה עם פרוטוקול זה. מיקרואורגניזמים עמידים לתרופות אחרות חשוב אשר גורמות דאגה רבה הינם של גראם חיוביים סטפילוקוקוס עמיד methicillin- Staphylococcus aureus (MRSA) ואת vancomycin עמידים Enterococci (VRE), את גראם שליליים Pseudomonas aeruginosa40,41.

עיכוב Biofilm ו את פעילות מיקרוביאלית של חומרים נגד סוגים אחרים של מיקרואורגניזמים כגון וירוסים, טפילים, אין אפשרות לבדוק עם פרוטוקול זה. עם זאת, פרוטוקול זה מספק נקודת התחלה שימושית מאוד לימוד מיקרוביאלית של חדש מתקדם בחומר.

בבדיקת דיפוזיה דיסק אגר מיקרוביאלית, שלב קריטי מתרחשת כאשר הדיסק לדוגמה יש להציב במרכז הצלחת כי כמה חומרים לקפל ברגע שיגיעו בקשר עם כלי התקשורת אגר. במקרה זה, מומלץ להשתמש זוג עקר פינצטה להתגלות בקפידה את הדגימה. מצד שני, בשיטת קשר, זה קריטי כדי לשטוף את הפקד ולהישאר מדגם דיסקים היטב עם PBS מאת pipetting אותם ארבע פעמים ולאחריו, נמרצת vortexing ו sonication על מנת להבטיח כי אין מיקרואורגניזמים קיימא מודבקת לחומר השטח.

פרוטוקול וידאו זה יכול להיות מנוצל ביישומים בביו-הנדסה רבים, כגון bioprocess הנדסה, הנדסת רקמות, תרופות מבוקרת, חומרי אריזה, טיפול בשפכים, חקלאות, אשר השתמש biomaterials עם מאוד קיבולת מיקרוביאלית רצוי.

התוצאות המתקבלות עם פרוטוקול זה הינן איכותיות (התמונות), תפוקה (הרוחב המנורמל של אנטיבקטריאלי “היילו” ואובדן של הכדאיות) עם ניתוח טוב של הפארמצבטית שלו (זאת אומרת ± סטיית תקן). בעת השוואה בין חומרים שונים, יש לנתח ערכים אלה אומר שהושג עם ניתוח תוצאות שיטת דיפוזיה ואיש קשר על ידי חד-כיווני אנובה, ואחריו ניתוח פוסט הוק של טורקיה, כדי שיוכל ללמוד אם הם, מבחינה סטטיסטית, באופן משמעותי שונות (p < 0.01).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים, הייתי רוצה להכיר את אוניברסיטת Católica דה ולנסיה סן ויסנטה Mártir על התמיכה הפיננסית לעבודה זו דרך 2017-231-001UCV ומענקים 2018-231-001UCV.

Materials

Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health?. Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?. Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better!. J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res – Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
  34. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, &. #. 1. 9. 3. ;., Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. . . ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x ’20 progress–development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Tags

Antimicrobial CharacterizationAdvanced MaterialsBioengineeringAntimicrobial ProtocolAntimicrobial ActivityStaphylococcus AureusEscherichia ColiCandida AlbicansTryptic Soy BrothTryptic Soy AgarColony Forming UnitsMicrobial Suspension

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image