JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Antimikrobiyal Biyomühendislik uygulamalar için gelişmiş malzeme karakterizasyonu

Published: August 04, 2018
doi:
10.3791/57710
, ,
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales,Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir

Summary

İleri düzey malzemeler antimikrobiyal karakterizasyonu için bir protokol tanıtacağız. Burada, malzeme yüzeylerde Antimikrobiyal aktivite birbirini tamamlayan iki yöntemine göre ölçülür: bir agar disk difüzyon testi üzerinde dayanır, ve diğeri de ISO 22196:2007 norm dayalı standart bir prosedür.

Abstract

Gelişmiş özellikleri ile yeni ileri düzey malzemeler geliştirilmesi Biyomühendislik uygulamaları geniş bir daha fazla önem kazanmaktadır. Böylece, birçok roman Biyomalzeme doku mühendisliği ve kontrollü ilaç dağıtım gibi biyomedikal uygulamalar için gerekli belirli ortamlarda taklit edecek şekilde dizayn edilmektedir. Hücreleri veya enzim immobilizasyon için gelişmiş özelliklere sahip malzemeler de geçerli araştırma konusunun Biyoproses Mühendisliği gelişmedir. Ancak, bu uygulamalar bir malzemenin en çekici özelliklerinden biri istenmeyen bulaşmaları önlemek için antibiyotik kapasitesidir. Bunun için biz takip etmek kolay iletişim kuralları (i) agar disk difüzyon testi (difüzyon yöntemi) ve (ii) ISO 22196:2007 norm malzeme yüzeylerde (temas Antimikrobiyal aktivite ölçmek için temel malzemeleri antimikrobiyal karakterizasyonu için mevcut yöntemi). Bu iletişim kuralı mikroorganizmaların geniş bir kapsayacak şekilde gram pozitif ve gram-negatif bakteri ve Maya kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Örnek olarak, Staphylococcus aureus, Escherichia colive Candida albicanskarşı bu protokol sonrası 4 malzeme farklı kimyasal doğa ile test edilir. Bu testlerin sonuçlarını ilk malzeme ve 3 diğer malzemeler için gram pozitif ve gram-negatif bakteri karşı antibakteriyel etkinliği artan için sigara Antimikrobiyal aktivite sergilemek. Ancak, 4 malzemelerin hiçbiri Candida albicansbüyümesini inhibe edebiliyoruz.

Introduction

İmplantın başarısızlık kez antimikrobiyal profilaksi ve aseptik çalışma koşulları rağmen oluşan mikrobiyal enfeksiyonlar bir sonucudur. Bu sorun çok yüksek sağlık maliyetleri neden ve hasta1arasında üzücü olduğunu. Önemli bakteri Staphylococcus aureus gibi şu anda çok tehlikeli patojenler Nozokomiyal Enfeksiyonlar II kateterler ve diğer tıbbi implant ile ilişkili olduğu kabul edilir ve tıp aletleri2ana kirletici vardır. Bu nedenle, roman antimikrobiyal strateji geliştirme acilen günlük ve tıbbi kullanımlar için gereklidir.

Antimikrobiyal ajanlar antibiyotik3, kuaterner amonyum bileşikleri4, metal iyonları/oksitler5ve antimikrobiyal peptidler (amper)6içerir. Antibiyotik yavaş yavaş nedeniyle bakteri direnci7artış nedeniyle antibiyotik aşırı8olduğunu, daha az verimli hale gelmektedir. Kuaterner amonyum bileşikleri sadece nedeniyle9microbial direnci kısa süreli kullanım için çok etkilidir. Metal iyonları/oksitler uzun çok etkili antimikrobiyal ajanlar kullanılmaktadır ve bandaj, su filtreleri, boyalar, vb10,11,12de dahil olmak üzere birçok ortak ticari ürünlerde kullanılır. Ancak, bu tür bileşikleri-ebilmek var olmak zehirli memeli hücreleri13bazı türleri için kanıtlanmıştır.

Mükemmel antimikrobiyal ve immunomodulatory özellikleri14,15amper göstermek ve bakteri çok onlara karşı bir direnç geliştirmeye16zor görünmektedir. Ancak, saf amper üretmek için pahalı bir işlemdir; Bu nedenle, bir büyük ölçekli üretim uygun değildir. Böylece, stratejileri amper üreten sorunları olmuştur sayaç için (Örneğin, küçük moleküler antibakteriyel peptoid taklit eder17, peptoids18, α-peptidler19 ve β-peptidler20) geliştirdi. Metakrilat sona erdi polipeptitler ve polypeptoids antimikrobiyal ve zehirli boya21için sentez.

Geliştirme gibi ileri düzey malzemeler içinde saf yeni antimikrobiyal ajanların veya melez formu, önlemek ve kökenlerinin dirençli enfeksiyonların tedavisinde giderek gereklidir. Doku ve Biyoproses mühendislik gibi birçok Biyomühendislik alanlar için yeni ileri düzey malzemeler çok çeşitli geliştirilmiştir geliştirilmiş kimyasal ve fiziksel özellikleri ile son on yıl içinde çeşitli yöntemlerle: plazma polimerizasyonu üzerine aşılama bir hidrofobik yüzey22,23,24, crosslinking yoğunluk25,26terzilik, polimerizasyon çözüm27,28,29 , 30, porogen çözünme31,32ve tarafından Nanomalzemeler grafen oksit (GO)33,34,35,36 gibi birleşme ve karbon nanofibers (CNFs)37.

Bu yeni malzemelerin antimikrobiyal kapasite, çalışma onların potansiyel Biyomühendislik uygulanabilirliği katlanarak artış olabilir ve bu nedenle, temel haline gelmiştir. Biz bu yeni gelişmiş materyalleri antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir takip etmek kolay iletişim kuralı mevcut. Burada, numune hazırlama sonra iki tamamlayıcı yöntem takip edilmektedir: ilk agar disk difüzyon testi38 (difüzyon yöntemi) dayanır ve ikinci üzerinde antimikrobiyal etkinliğini ölçmek için ISO 22196:2007 norm39 temel alır malzeme yüzeyleri (iletişim yöntemi).

Protocol

1. numune hazırlama Malzeme örnekleri 10 mm çaplı diskler 10 mm çapında silindirik yumruk kesilmiş.Not: Kırılgan malzeme uygun steril çözücüler, 1 h için yumuşadı ve sonra diskleri kesti. Örneğin, çinko aljinat gibi hidrofilik maddeler bu protokol sonrası test edildi ve autoclaved suda örnek kırma önlemek için kesmeden önce ıslatılmış. Ancak, poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) gibi hidrofobik diğer malzemeler her türlü düzgün kesilmiş olduğu için önceki şişme gerek yoktur. Örnek malzeme diskleri bir vakum fırında 60 ° C’de kuru (< 10-2 Torr) 24 h için.Not: Bazı materyaller yüksek kurutma sıcaklığı gerekebilir. Ancak, Termal malzeme aşağılamak bir sıcaklık ulaşamadığı önemlidir. Dijital kumpas ile malzeme film kalınlıkları ölçmek.Not: Bu iletişim kuralı kullanımı sürekli ve benzer kalınlıkları ile malzeme filmlerin Antimikrobiyal aktivite farklı malzemelerin karşılaştırırken önerir. Her numune etanol 10 dk ve sonraki ultraviyole (UV) radyasyon her yan başına 1 h için daldırma tarafından sterilize.Not: UV radyasyon UV-C radyasyon bir 12,0 W lamba ile steril Petri kabına bir laminar akış başlık içinde her numune yerleştirerek gerçekleştirilir.Dikkat: çünkü mutajenik araştırmacılar kendilerini UV radyasyon için açığa değil. 1.1, 1.2, 1.3 ve 1.4 adımları gerçekleştirin. Denetim malzeme disklerle.Not: Denetim diskleri difüzyon ve iletişim yöntemi olarak polietilen tereftalat (PET) veya alternatif sigara antimikrobiyal malzemeler kullanılabilir. Ayrıca, nanokompozitlerin veya işlem görmüş malzemeler karakterize, ana malzeme kontrol malzemesi olarak kullanılmalıdır. 2. tavsiye edilen mikroorganizmalar Not: Çok çeşitli mikroorganizmalar karşı test edilmiş malzeme antimikrobiyal kapasite çalışmaya 3 farklı mikroorganizmalar kullanımı önerilir. 3 mikroorganizmaları saf kültürler: gram-pozitif bakteri Staphylococcus aureus, gram-negatif bakteri Escherichia colive Maya Candida albicans.Not: Diğer mikroorganizma türler de bu iletişim kuralıyla kuluçka koşulları gerekirse değiştirerek test edilebilir.Dikkat: Bu protokol için istihdam Mikroorganizma tipine göre gerekli Biyogüvenlik ölçümleri izlenmesi gerekir. Önceden steril veya autoclaved malzeme ile çalışabilir ve Bunsen burner mikrobiyal manipülasyon veya biyolojik güvenlik kabini bütün işlemi sırasında (gerekirse) aseptik koşullar sağlamak için;Not: Önerilen otoklav 121 ° C 15dk sırasında kültür ortamlar için ve 121 ° C çalışma malzeme ve biyolojik artıkları için 20 min sırasında koşullardır. 3. agar Disk difüzyon testi (difüzyon yöntemi) Not: bir sıvı difüzyon antimikrobiyal bileşiklerin ileri düzey malzemeler ana antimikrobiyal mekanizması olabilir durumlarda difüzyon yöntemi bu malzemelerin antimikrobiyal kapasitesi hakkında çok yararlı bilgiler sağlayabilir. Agar plaka merkezinde bulunan malzeme diske mikroorganizmaların büyüme inhibisyonu sonra 24 h kültürünün oluştuğu bir şeffaf halka bölgesi (halo) oluşabilir (bkz. Şekil 1). Difüzyon testi prosedürü Hazırlama ve otoklav tryptic soya agar (TSA) üreticinin yönergeleri izleyin. TSA steril Petri yemekler Bunsen brülör veya laminar akış kukuIeta kullanarak aseptik koşullar altında içine dökün.Not: TSA plakaları 4-6 mm kalınlığında olmalıdır. TSA ile 18-24 h 37 ° C’de bir kuluçka-Petri yemeklerinde tükenmesiyle için test edilecek farklı mikroorganizmalar kültür Hazırlama ve otoklav tryptic soya suyu (TSB) üreticinin yönergeleri izleyin. Tekerlekli sandalye basketbolu aseptik şartlarda Bunsen brülör veya laminar akış kukuIeta kullanarak önceden sterilize edilmiş serolojik pipet ile 50 mL önceden sterilize santrifüj tüpü dökmek. Kimden adım 3.1.3 25 mL steril pamuklu çubukla ve girdap kullanarak bir steril santrifüj tüpü bulunan TSB birkaç koloniler resuspend onları karıştırma bir üniforma elde etmek 1 dakika. Absorbans ayarlamak (vasıl 540 nm) ile spektrofotometre birimleri (CFU) mL oluşturan colony uygun sayıda kültürünün: yaklaşık 1.5 x 108 CFU/mL 1 x 106 -5 x 106 CFU/mL için mantar ve bakteri için.Not: Kültür ve küvet birimleri absorbans ölçmek için kullanılan spektrofotometre, türüne göre seçilmelidir. Girdap mikroorganizma dağılım geliştirmek ve kısaca bu mikrobiyal süspansiyon steril pamuklu çubukla daldırın için 5 saniye için mikrobiyal suyu. Sıvı fazlalığı kültür içeren tüp duvara basarak çubukla kaldırın. Mikrobiyal suyu süspansiyon ile steril pamuklu çubukla tüm yüzeyini mikroorganizma ile kapak ve 5 min için aşı sonra kuruması için 3 uçak TSA levha yüzeyine eşit olarak çizgi.Not: herhangi bir nem kaldırmak için TSA plakaları 10-15 dk önce aşılama için 37 ° C’de ters bir pozisyonda açık yerleştirilmesi gerekir. Onları bir ölçek etanol ile % 96 çeker ve sonra onları yanan Bunsen brülör veya alkol yazıcı ile bir çift cımbız sterilize. Test edilecek ve disk steril Cımbız kullanarak TSA plakaları ortasındaki denetlemek için örnek diskleri yerleştirebilirsiniz. Tükenmesiyle TSA tabak 24 h 37 ° C’de ters bir pozisyonda kuluçkaya.Not: herhangi bir kirlenme riski ortadan kaldırmak için bu ters bir pozisyonda TSA plakaları kuluçkaya için tavsiye edilir. Örnek disk TSA plakaları ayırır, ancak, bu adım ters bir pozisyonda gerçekleştirme. Bu durumda, bu tabakalar laminar akış başlıklı kuru için tavsiye edilir. Bu antimikrobiyal test tekrarlanabilirlik sağlamak için farklı günlerde en az quadriplicate içinde gerçekleştirilmelidir. Mikrobiyal süspansiyon konsantrasyon ve saflık denetlemeNot: Adım 3.1.7’Spektrofotometre ile belirlenen mikrobiyal konsantrasyon doğru olup olmadığını denetleyin ve mikrobiyal hiçbir çevresel bulaşma olduğunu emin olmak için aşağıdaki adımlar gereklidir. Mikrobiyal çevresel kirlenme mikrobiyal kolonileri çeşitli görünüm kültürünün 24 saat sonra tarafından kolayca tespit edilebilir. Ayrıca, Tekerlekli sandalye basketbolu orta yok mikrobiyal kirlenme ondalık seri dilutions onun manipülasyon sırasında bir negatif TSB kontrol plaka ile sağlanmış olur gerekir. (Adım 3.1.4 hazır) steril TSB aseptik şartlarda uygun autoclaved ipuçları ile bir micropipette kullanarak steril microcentrifuge tüpler içine dağıtmak. Bir tanesi bir negatif TSB kontrol kullanılacaktır. Ondalık seri dilutions adım 3.1.9 TSB içeren steril microcentrifuge tüpler’de kullanılan mikrobiyal suyu süspansiyon ile gerçekleştirin. Her seyreltme önceden sterilize Drigalski spatula ya da alternatif bir araç kullanarak TSA plakalar üzerinde 100 µL yayıldı. Ayrıca TSB orta 100 μL mikroorganizma (3.2.1. adımda hazırlanan) bir TSA plaka üzerinde olmadan bir negatif TSB kontrol plaka yayıldı. Tükenmesiyle TSA plakaları tükenmesiyle 37 ° C’de 24 h için kuluçkaya. Koloniler CFU/mL 3.1.7. adımda belirlenen benzer kontrol etmek saymak. Hiçbir mikrobiyal çevresel kirlenme ile tek tip kolonileri bir TSA tabaklarda olduğunu kontrol edin. Hiçbir mikrobiyal kirlenme yok kolonileri gösterilen TSB negatif kontrol plaka üzerinde olup olmadığını kontrol edin 4. malzeme yüzeyleri (iletişim yöntemi) üzerinde antimikrobiyal aktivitesi ölçümü Not: Ana antimikrobiyal mekanizması gelişmiş bazı malzemelerin yüzey temas olabilir durumlarda iletişim yöntemi bu malzemelerin antimikrobiyal kapasitesi hakkında çok yararlı bilgiler sağlayabilir. Bu yöntemde, mikroorganizmaların doğrudan malzeme yüzeyine yerleştirilir ve onların büyüme inhibisyon belirli bir miktar sonra belirlenebilir. İlk yordam Hazırlama ve otoklav TSB üreticinin yönergeleri izleyin. Tekerlekli sandalye basketbolu aseptik şartlarda Bunsen brülör veya laminar akış kukuIeta kullanarak önceden sterilize edilmiş serolojik pipet ile 50 mL önceden sterilize santrifüj tüpü dökmek. Tükenmesiyle test edilecek farklı mikroorganizmalar tüp TSB bir orbital Shaker (140 devir/dakika) ile 37 ° C’de bir gecede kültür Gecede kültür TSB 20 ml 50 mL önceden sterilize santrifüj tüp için yaklaşık 10 bir konsantrasyon içinde seyreltik6 CFU/mL (540, Spektrofotometre ile belirlenen nm).Not: Kültür ve küvet birimleri absorbans ölçmek için kullanılan spektrofotometre, türüne göre seçilmelidir. Bu kültürün ondalık seri dilutions TSB içeren steril microcentrifuge tüplerde gerçekleştirin. 100 µL TSA plakaları kültürünün yayılı ve tükenmesiyle 37 ° C’de 24 h için kuluçkaya. Koloniler yaklaşık 1 x 106 CFU/mL bir ilk hücre konsantrasyonu sağlamak için sayma Sonra 24 saat ve 24 saat steril 48-şey plaka kuyu ayıran sonra mikrobiyal sayım için test edilmiş malzemelerin her türdeki 4 örnek diskleri mikrobiyal sayım için denetim diskler yer 4. Her disk yüzeyine mikrobiyal süspansiyon 150 µL pipet. Mikrobiyal kontrol ve test malzemeleri (24 saat sonra) sayma 4.1.6 adımdan sonra tükenmesiyle 24 h 37 ° C’de 48-şey tabak içinde kalan 4 örnek diskleri kuluçkaya.Not: Bu 24 h kuluçka süresi daha kısa veya daha uzun zaman Büyüme inhibisyon çalışma için değiştirilebilir. 24 h, kuluçka sonra 4 örnek disk yüzeyine steril PBS 850 µL pipet ve mikrobiyal süspansiyon 150 µL ile karıştırın. PBS/mikrobiyal süspansiyon karışımı ve her disk 48-şey plaka toplamak ve bir 10 mL önceden steril tüp aktarabilirsiniz. Girdap PBS/mikrobiyal süspansiyon karışımı ve her disk için 1 dk, solüsyon içeren temizleyicide bu 50 Hz’de 5 min ve girdap bu hiç uygun mikroorganizmalar kalmasını sağlamak 1 dk için tekrar malzeme yüzeye yapıştırılır. Ondalık seri dilutions her sonicated kültür TSB içeren steril microcentrifuge tüplerde gerçekleştirmek ve TSA plakaları kültürünün 100 µL yaymak ve tükenmesiyle 37 ° C’de 24 h için kuluçkaya. Her örnek ve kontrol disk yüzeyi uygun mikroorganizmalar vardır kolonileri saymak. (CFU/ml) hücrelerin bu sayıda hızlı. Son mikrobiyal kültür örnek ve denetim diskler için bir fotoğraf çekmek. 5. antimikrobiyal sonuçları analiz Şekil 1: antimikrobiyal “halo” normalleştirilmiş genişliği ölçülerini. Bu panel inhibisyon bölge (dız) çapı ve disk çapı (d) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Difüzyon yöntemi sonuçları analiz Disk çapı (d) ve (dız) inhibisyon bölgesinin çapı ölçmek (bkz. Şekil 1) bir dijital kumpas ile.Not: İnhibisyon bölge veya antimikrobiyal “halo” antimikrobiyal malzeme disk tarafından üretilen mikrobiyal Büyüme inhibisyon sonucu olarak oluşturulur (bkz. Şekil 1). Nerede mikroorganizmaların büyümüş düzgün bir şeffaf halka bölgeyi kapatmak için örnek plaka kalanı ile karşılaştırıldığında gözlemlemek mümkündür (opak bölge). Denklem (1) uygulayarak antimikrobiyal “halo” in her yuvarlak yüzey (Batıhalo) normalleştirilmiş genişliğini belirler.(1) Ortalama ve standart sapma her örnek “belirlenen antimikrobiyal halo” 4 KBhalo değerleri normalleştirilmiş genişliği belirleyin. Son mikrobiyal kültür malzemesi disk ile bir fotoğraf çekmek.Not: İnhibisyon bölge (dız) çapı ve disk çapı (d) Ayrıca uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak 5.1.4. adımda alınan fotoğraf üzerinden ölçülebilir. İletişim yöntemi sonuçları analiz Denklem (2) göre kurtarıldı canlı mikroorganizmaların sayısını belirleyin.(2)Not: Burada, N uygun mikroorganizmalar cm testi numune2 başına kurtarılan sayısıdır; C plaka sayısıdır; D seyreltme faktörü olduğunu; A örnek disk çapı ile belirlenen cm2 testi numune yüzey alanı olduğunu. Denklem (3) uygulayarak hücre büyüme inhibisyonu yansıtacak şekilde canlılık (LV) kaybı belirler.(3)Not: C uygun mikroorganizmalar (N) ortalama sayısı CFU/mL•cm2kontrol örnekler 24 saat sonra kurtarılan, burada; S uygun mikroorganizmalar (N) CFU/mL•cm2testi numune 24 saat sonra kurtarılan, sayısıdır. Ortalama ve standart sapma her örnek 4 kararlı LV(%) değerleri ile canlılık kaybı belirler.

Representative Results

Bu iletişim kuralı, bir örnek olarak kullanıldı, mikroorganizmaların antimikrobiyal kapasitesi 3 karşı farklı kimyasal doğa’nın 4 malzemelerin test etmek için önerilen: Staphylococcus aureus, Escherichia colive Candida albicans . Kontrol disk (C, resim gösterilmez) oluştu olarak agar disk difüzyon testler (difüzyon yöntemi) Sigara Antimikrobiyal aktivite ilk malzeme (M1) için sergilenen ve gram-pozitif ve gram-negatif karşı antibakteriyel etkinliği artan bakteriler diğer 3 malzemeler için M2, M3 ve M4 (bkz. Şekil 2). Şekil 2: antimikrobiyal difüzyon yöntemi sonuçları. Bu panel kuluçka 24 h sonra 4 malzeme (M1, M2, M3 ve M4) disklerin (10 mm çap x 1 mm kalınlık) S. aureus ve E. coli karşı antimikrobiyal difüzyon yöntemi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 antimikrobiyal “(1) denklemi ile hesaplanan halo” (Kuzeyhalo) farklı örnek malzemeler için M1, M2, M3 ve M4 gram pozitif ve gram-negatif bakteri karşı farklı normalleştirilmiş genişlikleri gösterir. Ancak, 4 malzemelerin hiçbiri Maya Candida albicans (resimler gösterilmez) büyümesini inhibe başardık. Şekil 3: antimikrobiyal difüzyon “halo” sonuçları. Bu panel normalleştirilmiş “halo” (Kuzeyhalo) sonra 24 h, kuluçka her malzeme (M1, M2, M3 ve M4) disk için (10 mm çap x 1 mm kalınlık) S. aureus ve E. coli karşı gösterir. Farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı (p < 0,01). Ancak, örnek M1 Antimikrobiyal aktivite sergiledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Kontrol disk (C) ve Grampositive ve diğer 3 malzemeler (bkz: için gram-negatif bakteri karşı artan antibakteriyel etkinliği oluştu olarak iletişim yöntemi sonuçları da sigara Antimikrobiyal aktivite ilk malzeme (M1) için sergilenen Şekil 4). Şekil 4: antimikrobiyal iletişim yöntemi sonuçları. Bu panel 4 malzeme (M1, M2, M3 ve M4) yüzey Antimikrobiyal aktivite assay ISO 22196:2007 göre ilgili 90 mm plakaları, kuluçka S. aureus ve E. coli (10-4seyreltme faktörü) için 24 saat sonra gösterir. C denetim diskten kuluçka 24 saat sonra kurtarıldı canlı bakteri var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Canlılık (%) kaybı Denklem (2) ve (3) tarafından bu protokol için belirtildiği şekilde belirlendi (bkz Şekil 5). Şekil 5: canlılık iletişim yöntemi tarafından kaybı. Bu panel malzeme yüzeylerde M1, M2, M3 ve M4 S. aureus ve E. coli karşı canlılık (%) kaybı gösterir. Örnek M1 Antimikrobiyal aktivite sergiledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Ancak, 4 malzemelerin hiçbiri (ya da resimler gösterilmez) iletişim yöntemi tarafından Maya Candida albicans büyümesini inhibe başardık. Bu nedenle, bu 4 ileri düzey malzemeler 3 gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı olumlu antimikrobiyal sonuçlar gösterdi ve böylece yüksek antibakteriyel etkinliği gereksinimleri olan birçok Biyomühendislik uygulamalar için çok yararlı olabilir. Ancak, 4 malzemelerin hiçbiri Maya büyümesini inhibe başardık.

Discussion

Yeni ileri düzey malzemeler Antimikrobiyal aktivite üzerinde 2 mevcut yöntemleri temel 2 tamamlayıcı yordamlar oluşan bu takip etmek kolay iletişim kuralı tarafından çözümlenebilir: agar disk difüzyon testi38 ve Antimikrobiyal aktivite üzerinde ölçülen ISO 22196:2007 norm39göre malzeme yüzeyler.

Bu araştırma alanında birçok literatürde bildirilen antimikrobiyal test son derece tahlil bağımlıdır. Bu nedenle, çok ayrıntılı olması önemli ve tutarlı protokolleri laboratuvarlar arasında bir yerde. Bu makalede, bu yönde bir adımdır. Ayrıca, bu alanda daha az deneyimli ve ayrıntılı, adım adım yordamları takip etmek için doğru sonuçlar gerektiren pek çok araştırmacı için çok yararlı olabilir.

Bu iletişim kuralı malzemeler 10 mm çapında yuvarlak yüzey şekillerine kesme birçok türü ile kullanılabilir. Kırılgan malzeme kesim işlemi daha kolay işlemek 1 h için uygun bir çözücü içinde şişmiş. Böylece, Aljinatlar gibi hidrofilik maddeler autoclaved distile suda sulu. Etanol, keton ve diklorometan, gibi diğer solventler hidrofobik malzemeler 1 h için onları kesmeden önce şişmeye istihdam edilebilir. Ancak, bazı malzemeler poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) gibi şişmiş gerekmez ve doğrudan kesilebilir. Bundan sonra bu örnek malzeme diskleri bir vakum fırında kuru ve herhangi bir kirlenme riski ortadan kaldırmak için her numune etanol ve 1 h için UV radyasyon ile sterilize etmek çok önemlidir.

Bu iletişim kuralı TSA ve tekerlekli sandalye basketbolu Kültür Medya ve çok çeşitli mikroorganizmalar ulaşmak için 3 mikroorganizmaları saf kültürler kullanımı önerir: gram pozitif bakteri Staphylococcus aureus, gram-negatif bakteri Escherichia coli, ve Maya Candida albicans. Ancak, alternatif kültür medya ve diğer mikroorganizmalar ihtiyacı farklı kuluçka koşulları da bu iletişim kuralı ile kullanılabilir. Bazen, sadece 1 mikroorganizma yeni bir malzeme antimikrobiyal aktivitesinin ilk bir fikrim var test edilmiştir.

Önerilen 3 karşı güçlü antimikrobiyal aktivite farklı türleri mikroorganizmaların Ayrıca test edilebilir gibi metisiline dirençli Staphylococcus epidermidis (MRSE), antibiyotik dirençli patojenlere karşı gösterilen malzemeleri hangi başarıyla bu iletişim kuralıyla kullanılmıştır. Gram-pozitif metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve Vankomisin dirençli enterokoklar (VRE) ve gram-negatif çok endişe neden diğer önemli ilaca dirençli mikroorganizmaların çoğu Pseudomonas aeruginosa40,41.

Biyofilm inhibisyonu ve Antimikrobiyal aktivite karşı diğer tip-in virüs ve parazitler gibi mikroorganizmaların malzemelerin bu iletişim kuralı ile sınanamıyor. Ancak, bu iletişim kuralı çok yararlı bir başlangıç noktası yeni bir antimikrobiyal bir incelenmesi için malzeme gelişmiş sağlar.

Antimikrobiyal agar disk difüzyon testinde önemli bir adım oluşur örnek disk agar medya ile temas alır almaz bazı malzemeleri kat çünkü plaka ortasına yerleştirilen gerekir. Bu durumda, bu örnek dikkatle açılmak için cımbız steril bir çift kullanmak için tavsiye edilir. Öte yandan, iletişim yöntemi, denetimin yıkamak için önemlidir ve örnek diskler çok iyi onları ardından dört kez bir dinç vortexing ve sonication hiçbir uygun mikroorganizmalar sağlamak amacıyla pipetting tarafından PBS ile malzeme yapıştırılır kalır yüzey.

Bu video iletişim kuralı-ebilmek var olmak kullanmak Biyoproses mühendislik, doku mühendisliği, kontrollü ilaç dağıtım, ambalaj malzemeleri, atıksu arıtma ve biyomalzeme ile kullanmak tarım gibi birçok Biyomühendislik uygulamada bir çok arzu antimikrobiyal kapasitesi.

Bu iletişim kuralı ile elde edilen sonuçları nitel (görüntüler) ve nicel (normalleştirilmiş genişliğini antibakteriyel “halo” ve canlılığı kaybı), tekrarlanabilirlik (ortalama ± standart sapma) iyi bir analiz ile. Farklı malzeme karşılaştırırken, difüzyon ve iletişim yöntemi sonuçları analiz ile elde edilen bu ortalama değerler, istatistiksel olarak önemli ölçüde Eğer onlar are çalışma için Türkiye nin analiz, özel mesaj takip tek yönlü ANOVA tarafından çözümlenmesi farklı (p < 0,01).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir bu çalışma sayesinde 2017-231-001UCV için finansal destek için kabul etmek istiyorum ve 2018-231-001UCV verir.

Materials

Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health?. Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?. Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better!. J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res – Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
  34. Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, &. #. 1. 9. 3. ;., Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. . . ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x ’20 progress–development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Tags

Antimicrobial CharacterizationAdvanced MaterialsBioengineeringAntimicrobial ProtocolAntimicrobial ActivityStaphylococcus AureusEscherichia ColiCandida AlbicansTryptic Soy BrothTryptic Soy AgarColony Forming UnitsMicrobial Suspension

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image