Summary

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

Published: August 25, 2018
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Summary

Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Abstract

Le poulet embryonnaire est couramment utilisé comme un organisme modèle fiable pour le développement des vertébrés. Son accessibilité et son incubation courte période le rend idéal pour l’expérimentation. Actuellement, l’étude de ces voies de développement de l’embryon de poulet est réalisée en appliquant des inhibiteurs et des médicaments à des sites localisés et à de faibles concentrations en utilisant une variété de méthodes. Culture de tissus in vitro est une technique qui permet l’étude des tissus séparés de l’organisme hôte, tout en contournant en même temps beaucoup de limitations physiques présentes lorsque vous travaillez avec des embryons entiers, tels que la susceptibilité des embryons doses élevées de produits chimiques potentiellement mortels. Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver le poulet embryonnaire demi tête in vitro, qui présente de nouvelles opportunités pour l’examen des processus de développement au-delà des méthodes actuellement établies.

Introduction

L’embryonnaire poulet (Gallus gallus) est un organisme d’excellent modèle couramment utilisé dans le domaine de la biologie. Sa période d’incubation est d’environ 21 jours et beaucoup d’oeufs peut être incubés simultanément, rendant les expérimentation rapide et efficace. Peut-être plus important encore, l’embryon est également facilement manipulé, permettant l’étude approfondie des principaux processus de développement et des gènes et des protéines qui animent ces processus.

L’oeil de l’embryon de poulet est un organe complexe qui se développe par l’interaction d’un certain nombre de différents tissus semblables à beaucoup d’autres systèmes de corps. Cette méthode permet l’étude de l’évolution de ces tissus, en particulier à un stade avancé de développement. Par exemple, la rétine multicouche peut être particulièrement intéressante pour ceux qui étudient le développement du système nerveux. Des méthodes alternatives qui permettent l’étude des autres tissus de l’oeil comme la cornée, le corps vitréennes, la lentille, la sclérotique et les paupières sont bénéfiques pour les chercheurs. L’oeil embryonnaire de poulet contient également une série d’os plats, les osselets sclérales, qui peuvent servir de modèle pour l’étude des os intramembranaires induction et l’ossification en vertébrés1.

Actuellement, il existe un certain nombre de méthodes utilisées pour étudier le développement embryonnaire. Microinjections d’anticorps inhibiteurs ou autres molécules inhibitrices de la2,3, implanté chirurgicalement des microbilles imbibé d’inhibiteur4et électroporation5 sont toutes des méthodes pouvant servir à des gènes régulent ou protéines d’intérêt dans un embryon. Des méthodes similaires sont utilisés pour réguler positivement les protéines. Ces méthodes ne sont pas sans leurs limites. Par exemple, lors de l’utilisation de produits chimiques pour modifier le développement embryonnaire, l’effet létal sur l’embryon doit être évalué, et cela limite l’utilisation des méthodes susmentionnées pour les sites localisés d’application à des doses suffisamment bas pour assurer la survie de la embryon.

Culture de tissus in vitro a été utilisée dans un large éventail d’organismes pour étudier le développement et peut être utilisé pour contourner les limitations susmentionnées. Par exemple, les fémurs6et plume bourgeons7,8branches9 du poulet ont tous étudiés à l’aide de tissus cultivant des méthodes, comme ont les testicules des souris10 et les racines et les tiges des plantes11. Ces méthodes accordent aux scientifiques un degré élevé de contrôle sur le développement des tissus, comme la possibilité de varier la température et de modifier la disponibilité des nutriments. L’isolement des tissus de l’embryon entier rend également beaucoup moins sensibles à l’effet létal des produits chimiques, permettant ainsi à des études de manipulation à l’échelle mondiale à des concentrations plus élevées. Un autre avantage notable de la mise en culture in vitro est la préservation de l’environnement cellulaire du tissu ; l’arrangement des tissus reste relativement inchangée, ce qui permet d’étudier les interactions entre les différents tissus types9. Ainsi, in vitro culture ouvre portes supplémentaires expérimentale approches non disponible dans des modèles in vivo ou in ovo .

Actuellement, il est particulièrement difficile d’étudier l’évolution de le œil de poulet embryonnaire à l’aide de produits chimiques. Un certain nombre de membranes extra-embryonnaires couvre l’embryon, rendant difficile l’application de microbilles ou produits chimiques ; l’embryon est également très active dans l’oeuf comme elle vieillit, ce qui complique une méthode déjà difficile. Ce protocole permet un accès facile à le œil et des tissus entourant, en éliminant ces obstacles, tout en offrant de nouvelles possibilités d’examiner les processus de développement intérieur de le œil. Ce protocole a été créé pour étudier l’induction des osselets sclérales intérieur de l’oeil embryonnaire.

Protocol

Remarque : Pour les stades de l’embryon, utiliser le Hamburger et Hamilton12 (HH) mise en scène de table. 1. embryon Incubation Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur stérile, contrôle de la température à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité. Tournez les oeufs 1 x par jour et laisser incuber à HH34 (fécondation après 8 jours). 2. préparation et stérilisation du matériel <o…

Representative Results

En utilisant cette méthode, un oeil embryonnaire de poulet peut être cultivé de jour 8 de son développement (HH34) in vitro pendant 4 jours. Quatre jours de in ovo développement correspond à HH38. Cette méthode de culture soutient le développement des bourgeons de plumes autour de le œil et des paupières (Figure 1 b). Ces bourgeons de plumes ne sont pas présents dans…

Discussion

Ce protocole utilise des tissus établie des techniques de culture pour atteindre la croissance d’un oeil de poulet embryonnaire jour 8 (HH34) in vitro pendant 4 jours. Cette méthode de mise en réseau-culture a été initialement décrite par Trowell15. Nous avons optimisé un protocole de Pinto et Hall 1991 étude16 utilisant une membrane semi poreuse avec le réseau pour étudier les signaux inductifs entre les couches de tissus séparés des yeux embryonnair…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs voudrais remercier Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) pour son travail préliminaire à l’élaboration du protocole. Les auteurs tiens également à remercier Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) pour son expertise technique et d’assistance avec le tournage et la production de la portion audio/visuel du manuscrit. Daniel Andrews a été appuyée par le financement de l’Université Mount Saint Vincent et les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) le via une bourse de recherche de premier cycle. Tamara A. Franz-Odendaal est soutenue par une subvention à la découverte du CRSNG.

Materials

35 mm cell culture petri dishes Corning 353001 easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes Corning 353003 tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue Kimtech 34155 Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh n/a n/a stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes VWR 14673-010 Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium Gibco 12591-038 Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper Whatman 1454 090 semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs Dalhousie University Agricultural College n/a can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl) EMD SX0420-3 sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle VWR 89000-240 1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol Fisher Scientific BP82011 70% molecular biology grade
tupperware containers n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades VWR 55411-050 single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
dust mask 3M n/a 3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin Fisher Scientific 72210 10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS) n/a n/a 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes VWR 21008-216 presterilized centrifuge tubes
forceps FST n/a fine forceps
chick saline  n/a n/a  0.85% NaCl
tinfoil n/a n/a store-bought
paper towel n/a n/a store-bought

References

  1. Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
  2. Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
  3. Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
  4. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
  5. Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
  6. Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
  7. Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
  8. McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
  9. Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
  10. Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
  11. Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  13. Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).
  14. Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
  15. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
  16. Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
  17. Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
  18. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).

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Cite This Article
Andrews, D. D. T., Franz-Odendaal, T. A. Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues. J. Vis. Exp. (138), e57619, doi:10.3791/57619 (2018).

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