Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet
Summary
Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.
Abstract
Le poulet embryonnaire est couramment utilisé comme un organisme modèle fiable pour le développement des vertébrés. Son accessibilité et son incubation courte période le rend idéal pour l’expérimentation. Actuellement, l’étude de ces voies de développement de l’embryon de poulet est réalisée en appliquant des inhibiteurs et des médicaments à des sites localisés et à de faibles concentrations en utilisant une variété de méthodes. Culture de tissus in vitro est une technique qui permet l’étude des tissus séparés de l’organisme hôte, tout en contournant en même temps beaucoup de limitations physiques présentes lorsque vous travaillez avec des embryons entiers, tels que la susceptibilité des embryons doses élevées de produits chimiques potentiellement mortels. Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver le poulet embryonnaire demi tête in vitro, qui présente de nouvelles opportunités pour l’examen des processus de développement au-delà des méthodes actuellement établies.
Introduction
L’embryonnaire poulet (Gallus gallus) est un organisme d’excellent modèle couramment utilisé dans le domaine de la biologie. Sa période d’incubation est d’environ 21 jours et beaucoup d’oeufs peut être incubés simultanément, rendant les expérimentation rapide et efficace. Peut-être plus important encore, l’embryon est également facilement manipulé, permettant l’étude approfondie des principaux processus de développement et des gènes et des protéines qui animent ces processus.
L’oeil de l’embryon de poulet est un organe complexe qui se développe par l’interaction d’un certain nombre de différents tissus semblables à beaucoup d’autres systèmes de corps. Cette méthode permet l’étude de l’évolution de ces tissus, en particulier à un stade avancé de développement. Par exemple, la rétine multicouche peut être particulièrement intéressante pour ceux qui étudient le développement du système nerveux. Des méthodes alternatives qui permettent l’étude des autres tissus de l’oeil comme la cornée, le corps vitréennes, la lentille, la sclérotique et les paupières sont bénéfiques pour les chercheurs. L’oeil embryonnaire de poulet contient également une série d’os plats, les osselets sclérales, qui peuvent servir de modèle pour l’étude des os intramembranaires induction et l’ossification en vertébrés1.
Actuellement, il existe un certain nombre de méthodes utilisées pour étudier le développement embryonnaire. Microinjections d’anticorps inhibiteurs ou autres molécules inhibitrices de la2,3, implanté chirurgicalement des microbilles imbibé d’inhibiteur4et électroporation5 sont toutes des méthodes pouvant servir à des gènes régulent ou protéines d’intérêt dans un embryon. Des méthodes similaires sont utilisés pour réguler positivement les protéines. Ces méthodes ne sont pas sans leurs limites. Par exemple, lors de l’utilisation de produits chimiques pour modifier le développement embryonnaire, l’effet létal sur l’embryon doit être évalué, et cela limite l’utilisation des méthodes susmentionnées pour les sites localisés d’application à des doses suffisamment bas pour assurer la survie de la embryon.
Culture de tissus in vitro a été utilisée dans un large éventail d’organismes pour étudier le développement et peut être utilisé pour contourner les limitations susmentionnées. Par exemple, les fémurs6et plume bourgeons7,8branches9 du poulet ont tous étudiés à l’aide de tissus cultivant des méthodes, comme ont les testicules des souris10 et les racines et les tiges des plantes11. Ces méthodes accordent aux scientifiques un degré élevé de contrôle sur le développement des tissus, comme la possibilité de varier la température et de modifier la disponibilité des nutriments. L’isolement des tissus de l’embryon entier rend également beaucoup moins sensibles à l’effet létal des produits chimiques, permettant ainsi à des études de manipulation à l’échelle mondiale à des concentrations plus élevées. Un autre avantage notable de la mise en culture in vitro est la préservation de l’environnement cellulaire du tissu ; l’arrangement des tissus reste relativement inchangée, ce qui permet d’étudier les interactions entre les différents tissus types9. Ainsi, in vitro culture ouvre portes supplémentaires expérimentale approches non disponible dans des modèles in vivo ou in ovo .
Actuellement, il est particulièrement difficile d’étudier l’évolution de le œil de poulet embryonnaire à l’aide de produits chimiques. Un certain nombre de membranes extra-embryonnaires couvre l’embryon, rendant difficile l’application de microbilles ou produits chimiques ; l’embryon est également très active dans l’oeuf comme elle vieillit, ce qui complique une méthode déjà difficile. Ce protocole permet un accès facile à le œil et des tissus entourant, en éliminant ces obstacles, tout en offrant de nouvelles possibilités d’examiner les processus de développement intérieur de le œil. Ce protocole a été créé pour étudier l’induction des osselets sclérales intérieur de l’oeil embryonnaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole utilise des tissus établie des techniques de culture pour atteindre la croissance d’un oeil de poulet embryonnaire jour 8 (HH34) in vitro pendant 4 jours. Cette méthode de mise en réseau-culture a été initialement décrite par Trowell15. Nous avons optimisé un protocole de Pinto et Hall 1991 étude16 utilisant une membrane semi poreuse avec le réseau pour étudier les signaux inductifs entre les couches de tissus séparés des yeux embryonnair…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs voudrais remercier Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) pour son travail préliminaire à l’élaboration du protocole. Les auteurs tiens également à remercier Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) pour son expertise technique et d’assistance avec le tournage et la production de la portion audio/visuel du manuscrit. Daniel Andrews a été appuyée par le financement de l’Université Mount Saint Vincent et les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) le via une bourse de recherche de premier cycle. Tamara A. Franz-Odendaal est soutenue par une subvention à la découverte du CRSNG.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
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